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荧光测定法检测细菌内毒素含量的方法介绍

发布时间: 2022-10-25  点击次数: 85次

鲎试验法中,有不少方法可以检测细菌内毒素含量,其中一种就是荧光测定法

那荧光测定法在试验中是怎么进行操作的呢?

首先需要将荧光母素和鲎试剂充分混匀,这样蛋白分子在进行凝胶反应的同时,荧光素就可以将其标记上。

 

 

在凝胶逐渐形成的过程中,蛋白分子的聚合结构也会慢慢发生变化,与此同时,与荧光素结合的蛋白因子也会跟随水分子的运动从而进行同步旋转,使得荧光的偏光度会发生变化。这时,我们将荧光的偏光度设为P,垂直的荧光强度设为I1,水平的荧光强度设为I2,,然后可以看得出,P值会因为凝胶的凝固程度而发生变化,这个时候想要求出其中的值,可以根据下图公式计算得出:

 

 

根据此公式可以得出,P值和供试品中的细菌内毒素含量为线性关系。

在进行鲎试验时,荧光母素的常用浓度一般为0.02%,若荧光母素的浓度超过0.05%以上,蛋白分子的聚合结构就会受到抑制,发生明显的变化,而荧光母素的浓度在0.025%时,蛋白分子的聚合结构会受到轻微抑制。所以,我们一般选定荧光母素的常用浓度为0.02%。

鲎试剂在凝固的过程中会随时影响P值得变化。当凝胶逐渐凝固时,P值就会越来越大,而内毒素的浓度又决定了鲎试剂凝固的反应期的时间长短和P值的增大变化。

当内毒素值为10-2μg/ml的时候,P值就会在五分钟内开始产生增大的变化;若内毒素值在10-3μg /ml的时候,P值在30分钟时都不会又明显增大的变化;又若是内毒素值在<10-3μg /ml的时候,因内毒素的浓度值过小,鲎试剂凝固的反应潜伏期就会越长。这个时候就能根据P值的上升程度绘制出图像,从而得出回归直线方程值。

这时,我们设倾斜度为b,潜伏期为,计算b/t值。根据荧光母素浓度的不同计算出标准内毒素的值然后绘制成曲线图像,可以得出内毒素含量在10-810-3μg /ml范围时,整体是呈上升直线状的,可以得出相关系数0.9804

由此列出方程式 

Y = 0.0207 + 0.0797x,其中 (R = 0.9804)

由此标准曲线可以得出供试品中的细菌内毒素含量

需要注意的是,荧光测定法的试验操作均在0℃的环境中进行操作,在进行60分钟静置时,还需时刻观察试验的反应过程,然后每5分钟就需要进行一次测定。

总而言之,荧光测定法需谨慎、耐心,方可得到准确的结果。

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