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精准选择 助推高效 | PSNG—基因重组鲎试剂领域的重磅出击

发布时间: 2022-03-23  点击次数: 272次

在制药过程中,细菌内毒素的检测依赖于鲎血资源。随着注射剂、疫苗类、化学药品类等制剂品的需求不断增长,鲎血资源的使用率越来越高;同时,鲎试剂中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原,存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子导致的假阳性结果。所以,建立一套不依赖鲎生物进行细菌内毒素检测的快捷、高效的补充替代方法尤为重要。


鲎


作为新型的重组鲎试剂检测方法:PSNG、rFC则备受关注。


一、PSNG和rFC的概念


01 PSNG


PSNG(基因重组鲎试剂)是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂,该试剂不依赖鲎血资源,满足可持续发展的目标。


基因重组鲎试剂


基因重组鲎试剂


它*模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应,包含C因子、B因子、凝固酶原,一种拥有与传统鲎试剂相同酶联反应,同时又消除了与1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成假阳性结果的内毒素检测试剂。


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PSNG(上图右侧)成功去除了天然鲎试剂(上图左侧)的G因子干扰。


02 rFC


重组C因子法rFC)是通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分:C因子,激活的C因子直接剪切一个荧光底物,产生的信号被荧光酶标仪识别。相较于传统的动态LAL法,重组C因子法只有一种反应机制。


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反应机制:左侧为基因重组鲎试剂 右侧为重组C因子试剂


二、LAL、PSNG、rFC对比情况


作为新型的重组鲎试剂PSNG、rFC,与传统的鲎试剂LAL进行细菌内毒素检测时又会有什么不同呢?


01 PSNG与LAL在检测内毒素上比较

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(图1)

由图1所示,通过研究在显色底物存在下,使用三种重组酶原的多种组合,确定三种重组酶原是否能重建反应步骤。


结果证实,当三种重组酶原同时存在时,内毒素才能激活蛋白酶活性,得出了PSNG与LAL在检测内毒素上具有等效性。另外,研究证实了,三种重组酶原的蛋白酶活性大大增强,信号放大。


02 LAL、PSNG、rFC对内毒素敏感度比较


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(图2)


从反应机制上看,rFC缺少了级联放大的两个环节(加速反应),只能通过荧光检测人为放大(减少了来源于自然反应的特异性)。


如图2所示,凝血酶的活化是LAL信号放大的主要驱动力;B因子的活化是针对内毒素的特异性活化,由此可以得出,PSNG(rCR)敏感度比rFC更高。


03 PSNG与LAL检测时间比较


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(图3)


如图3所示,通过对一系列浓度RSE(细菌内毒素参考标准品)应用PyroSmart NextGen™(PSNG)和典型动态显色试剂检测得到的起始时间值,得出PyroSmart NextGen™较典型的动态显色试剂检测缩短了大约一半的时间


04 PSNG与LAL批间一致性比较

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(图4)


天然来源的LAL试剂具有固定的批次间变异性,而PyroSmart NextGen™试剂表现出批次间的一致性。图4所示,六个单独批次的PyroSmart NextGen™试剂的曲线标准趋于一致,证明PSNG具有重复性和可预测性的性能


05 PSNG与LAL对内毒素特异性比较


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(图5)


图5的X-Y轴分别表示的是加标/不加标1,3-β-D葡聚糖的各批次PyroSmart NextGen™和系列标准浓度的反应。结果显示了添加1,3-β-D葡聚糖对应用PyroSmart NextGen™对内毒素的检测不存在干扰,各批次间相关性良好


06 PSNG验证性能


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(图6)

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(图7)


如图6、图7所示,应用PyroSmart NextGen™在50-0.005 EU/mL内毒素范围内,在两批次、四个分析人员、三天内条件下,执行了24个性能验证实验。依据ICH Q2指南标准,结果显示各验证参数满足标准要求


07 PSNG、rFC、LAL针对检测样品的比较


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(图8)

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(图9)

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(图10)


图8、图9、图10所示,适合性/一致性研究测试了多个成品、水、缓冲液等样品,得出PyroSmart NextGen™较 LAL具有相等或较低的不干扰稀释倍数(NID)。另外,Muroi 等人报告了使用PyroSmart NextGen™前身 PyroSmart 试剂检测药典118种肠外注射药物得出了相似的结果。


基于以上数据得出结论,重组鲎试剂方法(rCR)适合于广泛的产品检测。可比性研究测试了多种来源的细菌内毒素和水样,证实应用PyroSmart NextGen™检测具有较好的相对回收率


08 PSNG、LAL、rFC方法对比


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(图11)


如图11 所示,PSNG优于重组C因子法。PSNG检测过程不需要更换方法和设备,就能继续同样的工作流程。


三、总结


从LAL、PSNG、rFC对比情况来看,PyroSmart NextGen™较rFC、LAL在细菌内毒素检测上具有较强的优势:



相比重组C因子内毒素检测方法,PyroSmart NextGen™内毒素检测试剂可以产生级联放大反应,使得内毒素检测更加高效和灵敏。


文章参考来源:PYROSMART NEXTGEN RECOMBINANT LAL REAGENT



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