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鲎试剂法检查细菌内毒素应注意的问题

发布时间: 2022-07-11  点击次数: 251次

一、试剂灵敏度的复核

为了保证检查细菌内毒素结果的准确性,用于实验的试剂应首先核对灵敏度。因为实际工作中,发现试剂均符合药典规定标准前提下,由于生产厂家不同,部分试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时,用相同标示值的试剂,出现不同结果。试剂灵敏度的复核是使用该试剂的前提。中国药典(2000)在灵敏度复核项下规定,只有当实测值λc0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以λ为该批试剂的灵敏度,同时要求所用试剂的灵敏度须小于供试品的内毒素限值,因此灵敏度的准确与否直接关系到判断结果的正误,应尽量选用测定值与标示值一致(λc =λb)试剂。有报道,用符合药典规定的灵敏度标示值相同的试剂检测同一检品,结果因试剂实测值与标示值间存在差异而出现了两种*不同的结果。因而先核对灵敏度可避免因试剂本身造成的判断失误。


二、供试品的稀释

在取样品时,要熟悉中国药典的内容,不能直接取大输液原液0.1ml进行检查,这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定实验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml,根据供试品的稀释公式:


供试品稀释倍数=L/λ


L:供试品的内毒素*


λ:试剂灵敏度的标示值(EU/ml)


故检测大输液均应稀释后才能进行实验,如选用更高灵敏度的试剂,则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与试剂产生凝集反应。如果直接用供试品原液实验,就会使供试品的内毒素要求提高到0.5EU/ml0.5EU/ml 以下,这样,根据目前大输液的生产和贮藏条件,有些就会达不到,法检出的阳性率会提高,兔法复核的机遇也将增多,势必会浪费人力物力。


以前细菌内毒素的限值是按照热原检查法所需的家兔剂量计算的,由于家兔剂量往往高于人用最大剂量的几倍甚至几十倍,势必造成对产品内毒素要求过于严格,使很多合格产品被判为不合格产品或使药品生产成本增加,所以在USPEP中,相继采用人用最大剂量来计算药品细菌内毒素的限值。如注射用头孢噻肟钠按中国药典(1995)规定的热原剂量计算其细菌内毒素限值,与USP的限值要求相差4倍,而用最大剂量计算则两者十分接近。


三、混合液的pH

供试液与益试剂混合液的pH值对实验的影响较大,根据国内外资料的报道,实验的最适pH6.25~7.25才能形成最佳凝胶试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制试剂与细菌内毒素的反应,其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。


四、保温温度

温度对试剂的灵敏度影响很大,保温温度在25~40℃之间,随着温度的升高,试剂的灵敏度亦增大,在40~46℃之间,温度对益试剂的灵敏度无明显影响,达到49℃或更高温度时,则会破坏试剂。故应严格按照药典的要求,温度控制在(371)℃之间,才可获得理想的结果。


五、振动的影响

试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此,在实验过程中,不宜进行容易引起试管振动的实验操作,实验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近,避安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方,保温过程中不可随时取出观察。



六、所用器皿的影响

所用器皿均应*洗净和灭菌,实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净,特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后,更应冲洗干净,以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理,防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。


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本文节选自:《细菌内毒素检测中问题的研究》,文章作者:岳丽娜。如有侵权,请联系删除,谢谢!


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