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凝胶法细菌内毒素检查的干扰因素

发布时间: 2022-07-18  点击次数: 62次

凝胶法是一种基于试剂中的多个酶蛋白在模拟的生理环境下进行的反应所以在反应过程中会受到很多生化因素的影响。此外由于内毒素本身的特性决定了容易被吸附和集聚所以采用凝胶法进行细菌内毒素检查时只有很少的非肠道用药没有干扰可直接检查大部分药物存在干扰。因此消除干扰因素的影响对于使用试剂凝胶法检查细菌内毒素显得十分必要。



一、凝胶法干扰类型

凝胶法试剂与内毒素反应受诸多因素主要有二大类抑制型干扰增强型干扰。在进行细菌内毒素检查时,当供试品含有的内毒素浓度2倍检测试剂的灵敏度但检测结果仍为阴性时即为抑制型干扰抑制型干扰的结果表现为“假阴性"当供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2但检测结果仍为阳性时即为增强型干扰增强型干扰的结果表现为“假阳性"

二、凝胶法干扰机制

抑制型干扰

1pH的影响

试剂与内毒素的反应是一个复杂的酶促反应因此其反应的介质要求有合适的pH最佳 pH范围6~8。为保证反应介质合适的pH,鲎试剂必须具有一定的pH缓冲能力。但有些检品本身要求在酸性或碱性的介质中保存且自身也具有一定的pH缓冲能力对这类检品进行细菌内毒素检查时试剂的pH缓冲能力就不足以使反应介质的pH缓冲到最佳范围会使反应受到干扰通常表现为抑制作用


2、内毒素修饰

内毒素是一个具有亲水疏水两个区域的两性分子这种结构使内素分子间或内毒分子与检品中成分结合形成微室内毒素的分散性是由脂质A形成高分子聚合物的功能和多糖与阳离子静电引力决定的当内毒素分子的聚集增加内毒素的反应性和热原性都显著下降通常检品中离子强度的较大提高会引起内毒素的聚集和回收率降低。


3、容器效应

内毒素稀释液贮存一段时间后会被破坏而失活即使经充分的旋涡混合也不能恢复其中可能有多种扰因素但容器效应是其中一个因素。


容器效应与接触内毒稀释液的容器材质有关主要表现壁对内毒的吸附聚丙烯材质还会对脂多糖复合物( LPS)产生深度抑制。血液透析器上存在试验反应物质(LAL-Reactive Ma-terial ,LAL-RM )凡经过铵人造丝透析膜的制品均存在使试验阳性但不是内毒素的物质。


另外稀释管洗涤后残留的洗涤剂也会形成微室影响内毒的分散。由于热原是G¯菌细胞壁的内毒素是含有膦酸链的脂多糖普遍存在于自然水和自来水中所有器具的处理是否恰当直接影响试验结果。用清洁液浸泡处理过的器具与未用清洁液处理的器具用法检测内毒素的结果差异明显用清洁液处理的器具可除去一些外源性内毒素未用清洁处理的器具虽然也经过干烤灭活但器具上吸附着的细菌死亡后也可释放出内毒素造成试验假阳性反应结果。



4、金属离子的影响

试剂中含有保持灵敏度而必需的单价和二价离子其中二价离子对反应和内毒素分散都起着重要作用Ca2+ Mg2+离子浓度的不适宜会抑制或增强反应但许多原因都会引起二价离子的不充足从而抑制试剂与内毒素反应的能力比如某些药物中入有机络合剂用来络合重金属离子起稳定作用肝素钠柠檬酸钠等抗凝剂都会络合钙离子抑制试验。


5、蛋白质或酶的修饰

凝胶现象是基于一系列丝氨酸蛋白酶的酶促放大作用产生的丝氨酸蛋白酶可以被氧化剂抗氧化剂蛋白水解剂或专一失活剂所灭活这些都会引起抑制乙醇对蛋白质有变性作用因而要限制其在样品中含量。

增强型干扰

试剂与内毒素和葡聚糖可以共同反应且存在内毒素与葡聚糖共同作用时,鲎试剂的凝胶反应比对单一物质作用更迅速更剧烈。这些葡聚糖等物质并不象内毒素一样具有致热性迄今为止的研究未表明其对人体有害但一旦受到葡聚糖的轻微污染就使得一些药品虽然内毒素含量并未超过规定限值也会使内毒素检查呈现"假阳性"易被误判为不合格。



含糖大输液与普通试剂的凝胶试验呈较高的阳性反应而且糖浓度越高装量越大阳性反应率越高叶良君等认为葡萄糖原料中含有微量的(1-3)-B-D-葡聚糖以及输液的制备工艺如制水时自来水和过滤时中性纸与微孔混合纤维素膜带入的(1-3)-B-D-葡聚糖及其类似物的污染通过β-葡聚糖激活普试剂中的G因子而发生旁路反应引起凝集反应而出现假阳性结果。含有丝氢酸蛋白酶的生物制品也会产生类似内毒素的反应胰酶在一定条件下就具有反应性加热处理可灭活胰酶然后再作试验分析能真正消除这种"假阳性"反应。


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