细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的正确使用方法

细菌内毒素作为外源性致热原的内毒素能激活中性粒细胞等，是革兰阴性菌细胞壁个层上的*结构，会使中性粒细胞释放一种叫内源性热原质的物质，其在体温调节的中枢会引起发热反应。当内毒素经消化道进入人体不会产生危害，但内毒素经注射液等方式进入血液时则引起症状不同的疾病。因此，药品安全性检验一个重要项目就是药品注射剂中细菌内毒素检查。美国科学家Levin和Bang1968年建立鲎试验法来检查细菌内毒素，美国FDA于1973年制定的规则指出“鲎试剂是一种检测细菌内毒素的灵敏指示剂。"

1.鲎试剂的特性及与内毒素产生反应的作用机理

鲎试剂是细菌内毒素检查法中最重要的试剂。它是鲎科血细胞（变形细胞）裂解液的冻干产物。鲎的血液中只有一种类型的血细胞参与循环就是被称为变形细胞。目前制备细胞鲎试剂一种是东方鲎，另一种是美洲鲎。研究鲎试剂作用机理表明，细菌内毒素激活鲎试剂中鲎血细胞溶解物，产生一系列的凝集酶反应，形成凝固蛋白凝胶。判断供试品中细菌内毒素的限-量能否在规定范围，可通过用鲎试剂检测，或者是量化革兰阴性菌所产生细菌内毒素。

2.细菌内毒素检查法

2.1内毒素标准品

细菌内毒素国家标准菌株由大肠杆菌提炼精制而成，是用来检查，校准，仲裁鲎试剂灵敏度、细菌内毒素浓度测定，干扰测试和测试方案中供试品阳性对照和阳性对照溶液的制备和光度测定方法的可靠性测试、凝胶检查鲎试剂试验敏感性。国家标准是细菌内毒素校准的参照标准，单位为内毒素（EU），1EU等于1国际单位内毒素（IU）。

2.2实验准备

玻璃器皿在酪酸洗液、其他热源性灭活剂、或清洗剂将充分浸泡，控干洗液后用蒸馏水3遍以上的冲洗，放入干燥箱，在250℃干烤30min以上，用以除掉可能性存在外源性内毒素干扰。如果用塑料的器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。

无热原酶标板

2.3鲎试剂灵敏度复核

将细菌内毒素采样标准品与专门的检查水在涡流搅拌器中混合溶解15min，稀释后测定鲎试剂的灵敏度值（λc）。每一批新批次鲎试剂全部需严格采用灵敏度试验。

2.4实验方法

将8支鲎试剂分别加入细菌内毒素检查用0.1mL水溶解。按最大稀释倍数稀释的供试品溶液0.1mL加入2支，作为供试品溶液管，2支加入含内毒素浓度为2λ对照溶液为供试品阳性对照管，2支加入2λ内毒素工作标准品溶液0.1mL作为阳性对照管，2支加入细菌内毒素检查用水0.1mL作为阴性对照管。试管混匀封口置于37C±1℃恒温器中保温60分钟±2分钟，从恒温器中慢慢取出，极缓的倒转180°，若未形成凝胶，或者形成凝胶不坚实、变形体从管壁下滑脱落为阴性；管内出现凝胶并且凝胶不变形、如果不从管壁下滑脱落即为阳性。拿取或者保温试管时要避免振动，以免出现假阴性检测结果。

细菌内毒素工作标准品

2.5实验注意事项

准备工作：肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。应在清洁环境中进行操作，取样时防止混入气体，并防止微生物污染移液管。