选择性清除内毒素的最佳吸附条件

图35-3显示了从蛋白质溶液中吸附内毒素的原理。阴离子交换配体和一切内毒素选择性配体在工作条件下带正电荷网，如此，带负电荷的蛋白质和内毒素在低离子力时被吸附，此时蛋白质和内毒素几乎不能回复。当吸附能力耗尽之后（不取决于是否系内毒素特异性），蛋白质的回复便可接近100%。所采用配体的结合位点的多少对蛋白质和内毒素来讲是一样多的，所以蛋白质和内毒素对这些结合位点的竞争影响了内毒素的清除。同样，对于一些已经被吸附的内毒素来说，在蛋白质浓度比内毒素浓度高出6个数量级的情况下也是可以被取代下来的。

另一方面，内毒素和带阳离子电荷网的蛋白质形成复合物以致亲和配体和蛋白质竞争内毒素，如果在吸附剂表面的电荷密度高或者使用一种选择配体，使得平衡倾向于吸附剂，则可使内毒素得到去除。当带阳离子电荷网的蛋白质从阴离子交换剂上解脱时，能得到几乎100%的蛋白质。

迄今为止，以上所提及的吸附剂没有一个已被实际用于蛋白质溶液的内毒素清除。但是，离子力起到了重要的作用，特别是在吸附过程的最初阶段。低离子力的物质，相当于小于50mmol/L的NaCl，常被推荐用作离子交换剂。具有较高离子力的物质如多黏菌素B和DAH，在被用作亲和吸附剂时，与配体的结合主要依靠离子间作用力和疏水作用。在合适的条件下，其关系常数超过109。多阳离子配体较少依靠离子力。蛋白质的去污染与其在环境条件下的等电点及pH值稳定性有很大的关系。一般来说，当pH值接近蛋白质的等电点时，内毒素能最大限度地被去除。强碱或强酸性蛋白质的化学特性使其在纯化时发生不可逆的丢失，而且沉淀反应也是一个问题，所以必须寻找一个折中的办法。对于酸性蛋白质而言，环境pH值应该尽可能接近PI，同时应该采用多聚的或疏水性弱的配体。等电点接近7的蛋白质应该在pH≈PI的环境下进行去污染。虽然用内毒素选择性配体能得到更好的结果，但阴离子交换剂也可以采用。离子交换剂对碱性蛋白质的去污染结果也相当不错，特别是带有4条氨基酸基团的配体，它在碱性条件下能显示出较高的离子密度，并在提高pH值后与内毒素的吸附相当匹配。

应该注意到，不仅仅是带净电荷的蛋白质，也包括所有阳离子配体，其电荷密度随着pH值的改变会发生变化，但除外那些有4条氨基酸的配体。pH值的升高可导致电荷密度的减少，具体数值可因配体的pK或pI而有差别。

如果内毒素和带负电荷的蛋白质之间的作用是由Ca2+介导的，则应该辅以1～5mol/L的EDTA。EDTA是一种强螯合剂，可使蛋白质-Ca2+-内毒素复合物的平衡倾向于解离，由此增进吸附剂的去污效果.此外，如果要采用辅以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不带电荷的去污剂，则应事先筛选，因为在应用这些物质时会带来其他问题。

评价层析柱在耗尽其蛋白质结合能力之后留在柱里面的内毒素的量是十分必要的，这在部分吸附时也是一样的道理，即蛋白质或内毒素浓度的变化会同时影响到清除效率和蛋白质的回收。