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鲎血变形细胞裂解物的制备

发布时间: 2023-10-13  点击次数: 311次
我们了解到,鲎血液中含有一种细胞即变形细胞,这种细胞内的溶解物(裂解物tachypleus lysate,TL)可与微量细菌内毒素起凝集反应,这是由TL中的一种酶被细菌(革兰阴性菌)细胞壁成分——脂多糖激活,使其蛋白质形成凝胶所致。为此人们已阐明了这方面的理论机制,并已着手利用各种技术从自然界存在的某些物质中把它提取出来,实践并应用于社会,鲎变形细胞内的溶解物主要有两种,凝固蛋白原及凝固蛋白酶原。这两种物质提取后,即为检测内毒素的益试剂,它的检测灵敏度高低取决于制备擞血细胞溶解物的质量。因此,在制备提取过程中不能有微量的内毒素进入,所以,鲎试剂的制备提取过程是有相当难度的。

一、材料与制备
1、鲎

采用我国东南沿海地区的鲎即东方鲎(中国鲎),采血量最多为400ml,平均200ml(需根据体重大小而定),其变形细胞数最高为5×1011/L以上,平均为4×1010/L。

2、器材及处理

准备采血瓶(250ml玻璃瓶)注射器等用具,经洗涤后放在重铬酸钾与硫酸的清洁液中浸泡过夜,然后用无内毒素的流水冲洗3次,晾干后于260℃烤箱内烘干3h备用。采血针、管均需用一次性无菌采血器(均无内毒素)。

3、试剂配制

以下试剂中凡是固体试剂均需预先去除内毒素,去内毒素的方法要视各种试剂的耐热度而定,一般用80~120℃不间断烘烤约10h左右。配制试剂用的重蒸馏水应不含内毒素(小于0.03EU/ml内毒素含量)。

  1. 抗凝剂1:茶-碱(theophylline)2g;磷-酸-氢-二-钠(Na2HPO4·12H2O)2g;氯化钠40g;无内毒素蒸馏水1000ml。

  2. 抗凝剂2:茶-碱0.36g;磷-酸-氢-二-钠2g;氯化钠4g;无内毒素蒸馏水1000ml。

(3)洗涤液:磷-酸-氢-二-钠2g;氯化钠40g;无内毒素蒸馏水1000ml。

(4)裂解液:将0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)用盐酸调节至pH值为7左右,也可加入二价阳离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+等提高灵敏度。
二、制备步骤

1、采血 
取活鲎用水冲洗,将鲎屈曲,露出头、胸、腹三节交界处,用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G针头一次性输血器,针尖插入盛有100ml抗凝剂1的瓶中,另一端的针头刺入鲎的头腹部关节处深入约1~2cm,蓝色血液就流入瓶内,每瓶采血100ml,注意稳定针头,使其不要移动。在采血过程中,鲎血应是顺畅地流入瓶中,若发生间歇滴入就容易凝固,应即弃去不用。采血后立即用1000r/min离心约2min。离心后,变形细胞沉积于瓶底,呈白色,此时弃去上层蓝色血液即可。


2、洗涤
用抗凝剂2-20ml加入瓶中轻轻摇晃,使沉淀的变形细胞均匀地分散混悬于抗凝剂中,然后以1000r/min离心1min。弃去上清液后用4%氯化钠磷酸盐溶液洗涤3次,之后再次离心约1500r/min 1min,将细胞压实,弃去上清液。

3、裂解
将压实的变形细胞加入约3倍裂解液后使细胞计数在5×1011/L,变形细胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱内,每天震荡2次,以使细胞裂解完-全。析出的液体应透明无色。

4、分装冻干
将裂解物以3000r/min离心15min,收集上清液分装于安瓻中,放置于医用冷冻干燥机中,-30℃快速冷冻,然后于真空状态下升温干燥,升温不超过20℃。冷冻干燥后即可得到标准灵敏度的鲎试剂成品。
三、制品检测

1、使用凝胶法进行鲎试剂成品内毒素测定,标准内毒素含量为10EU/支,准确加λ无内毒素用水(以下简称水)1.0ml,溶解,用封口膜封住安瓿口。

2、将封口安瓿放λ旋涡混合器上旋涡混合,一般情况下国家标准品是20~30min,工作标准品是10~15min(其要求的理由下述会阐明)混合时注意不要使安瓿内溶液沾上封口材料。

3、将混合好的内毒素溶液(此时浓度为10EU/ml)用水稀释为2λ、λ、0.5λ及0.25λ浓度的系列浓度(λ为灵敏度),即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml浓度的系列溶液。

4、操作方法:①取20支无内毒素试管分为4组,每组分别标记上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0(空白管阴性对照)。②分别吸取鲎试剂0.1ml 加入E0至E1的对应试管。③E0管加入0.1ml水,其余各管加入0. 1ml与管上标注数字相同浓度的标准内毒素。④用封口膜封闭试管,将试管内容物轻轻摇匀。⑤把试管架放入37±2℃的恒温水浴中保温60±2min。在保温过程中不能有任何震动,以免影响反应的正常进行。保温时间结束后将试管取出观察结果,注意,E0管需保温至4h才取出观察结果。⑥实验结果判断:将试管缓慢翻转180°,若管内凝胶显示坚实不变形为阳性,记录为“+";若无凝胶出现﹐或疑有凝胶但不能保持完整,从管壁滑脱,均判为“阴性",记录为“-"。



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