鲎血变形细胞裂解物的制备

采用我国东南沿海地区的鲎即东方鲎（中国鲎），采血量最多为400ml，平均200ml（需根据体重大小而定），其变形细胞数最高为5×10¹¹/L以上，平均为4×10¹⁰/L。

准备采血瓶（250ml玻璃瓶）注射器等用具，经洗涤后放在重铬酸钾与硫酸的清洁液中浸泡过夜，然后用无内毒素的流水冲洗3次，晾干后于260℃烤箱内烘干3h备用。采血针、管均需用一次性无菌采血器（均无内毒素）。

以下试剂中凡是固体试剂均需预先去除内毒素，去内毒素的方法要视各种试剂的耐热度而定，一般用80~120℃不间断烘烤约10h左右。配制试剂用的重蒸馏水应不含内毒素（小于0.03EU/ml内毒素含量）。

1. 抗凝剂1：茶-碱（theophylline）2g；磷-酸-氢-二-钠（Na₂HPO₄·12H₂O）2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。

2. 抗凝剂2：茶-碱0.36g；磷-酸-氢-二-钠2g；氯化钠4g；无内毒素蒸馏水1000ml。

（3）洗涤液：磷-酸-氢-二-钠2g；氯化钠40g；无内毒素蒸馏水1000ml。

（4）裂解液：将0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）用盐酸调节至pH值为7左右，也可加入二价阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺等提高灵敏度。
二、制备步骤

1、采血 
取活鲎用水冲洗，将鲎屈曲，露出头、胸、腹三节交界处，用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G针头一次性输血器，针尖插入盛有100ml抗凝剂1的瓶中，另一端的针头刺入鲎的头腹部关节处深入约1～2cm，蓝色血液就流入瓶内，每瓶采血100ml，注意稳定针头，使其不要移动。在采血过程中，鲎血应是顺畅地流入瓶中，若发生间歇滴入就容易凝固，应即弃去不用。采血后立即用1000r/min离心约2min。离心后，变形细胞沉积于瓶底，呈白色，此时弃去上层蓝色血液即可。

2、洗涤
用抗凝剂2-20ml加入瓶中轻轻摇晃，使沉淀的变形细胞均匀地分散混悬于抗凝剂中，然后以1000r/min离心1min。弃去上清液后用4%氯化钠磷酸盐溶液洗涤3次，之后再次离心约1500r/min 1min，将细胞压实，弃去上清液。

3、裂解
将压实的变形细胞加入约3倍裂解液后使细胞计数在5×10¹¹/L，变形细胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱内，每天震荡2次，以使细胞裂解完-全。析出的液体应透明无色。

4、分装冻干
将裂解物以3000r/min离心15min，收集上清液分装于安瓻中，放置于医用冷冻干燥机中，-30℃快速冷冻，然后于真空状态下升温干燥，升温不超过20℃。冷冻干燥后即可得到标准灵敏度的鲎试剂成品。
三、制品检测

1、使用凝胶法进行鲎试剂成品内毒素测定，标准内毒素含量为10EU/支，准确加λ无内毒素用水（以下简称水）1.0ml，溶解，用封口膜封住安瓿口。

2、将封口安瓿放λ旋涡混合器上旋涡混合，一般情况下国家标准品是20~30min，工作标准品是10~15min（其要求的理由下述会阐明）混合时注意不要使安瓿内溶液沾上封口材料。

3、将混合好的内毒素溶液（此时浓度为10EU/ml）用水稀释为2λ、λ、0.5λ及0.25λ浓度的系列浓度（λ为灵敏度），即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml浓度的系列溶液。

4、操作方法：①取20支无内毒素试管分为4组，每组分别标记上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0（空白管阴性对照）。②分别吸取鲎试剂0.1ml 加入E0至E1的对应试管。③E0管加入0.1ml水，其余各管加入0. 1ml与管上标注数字相同浓度的标准内毒素。④用封口膜封闭试管，将试管内容物轻轻摇匀。⑤把试管架放入37±2℃的恒温水浴中保温60±2min。在保温过程中不能有任何震动，以免影响反应的正常进行。保温时间结束后将试管取出观察结果，注意，E0管需保温至4h才取出观察结果。⑥实验结果判断：将试管缓慢翻转180°，若管内凝胶显示坚实不变形为阳性，记录为“+"；若无凝胶出现﹐或疑有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为“阴性"，记录为“－"。