关于细胞和组织疗法的内毒素检测阐述

一、介绍

在科学进步和希望利用这些进步的新投资的推动下，研究人员和临床医生正在开发创新的细胞疗法。出于两个原因，控制此类治疗制剂中的内毒素污染非常重要。首先，由于内毒素会对受体产生影响，因此给患者注射的制剂不能受到严重污染。其次，内毒素是多种细胞反应的强效诱导剂，可能会改变细胞的治疗价值。

二、细胞疗法解析

以细胞和组织为基础的疗法（本文中称为细胞疗法）是一种特殊的肠外产品，其中给患者注射的是活细胞。细胞可以来自患者（自体），这样可以防止对细胞的免疫反应。另一种方法是从另一个人身上采集细胞（异体来源），在这种情况下，供体组织可能与受体匹配，以减少对疗法的免疫反应，但这种疗法通常需要使用免疫抑制药物。第三种方法是使用异种细胞（从其他物种获得的细胞），这可能也需要使用免疫抑制药物。

将细胞转移到培养基中用于后续的储存、生长、操作、转化或收获（以及其任何组合）。在简单的治疗形式中，细胞无需对之前收获的自身细胞进行任何操作即可返回患者体内。这通常是在治疗减少淋巴细胞计数后进行的。对于其他疗法，可以在使用之前操作或刺激所使用的细胞或组织。

细胞疗法可以通过输注药物、注射或手术植入，以聚集形式或具有支撑或封装材料，可被视为医疗器械的物品。供者（通常是患者）体内的细胞通常是无菌的，并且不含可检测到的内毒素。令人担忧的是，它们在收集、储存、操作（如果适用）和返回患者体内的过程中会受到污染。

三、内毒素的意义

内毒素是一种有效的生物反应调节剂。如果在细胞治疗中作为污染物存在，可能会影响患者和/或被施用的细胞。第一个问题是对患者的潜在影响，这对于接触血液、淋巴系统或脑脊液的其他注射产品和医疗器械来说很常见。这些产品穿透或绕过皮肤和肠壁的保护屏障，有可能将内毒素直接引入血液。通过口腔摄入的内毒素通常不会对健康造成有害影响，因为它不会穿过肠壁进入血液。内毒素是由口腔和肠道中的细菌产生的；它存在于食物和自来水中，有时浓度超过1000EU/mL。相反，内毒素如果进入血液，会引起发烧（热原反应）和一系列其他可能的影响，包括感染性休克和死亡，这是危险的。因此，将治疗剂直接引入患者血液的治疗方法，如注射、输注或作为医疗设备，必须控制内毒素污染。

第二个考虑因素是内毒素对待给药细胞的影响。内毒素对细胞的影响在《LAL更新》第16卷第1期生物技术细胞培养中进行了讨论。同样的原理也适用于细胞治疗。关注的影响包括有丝分裂的诱导、细胞因子的刺激产生（细胞因子本身可能是热原性的）、形态变化和细胞毒性。因此，在存在内毒素的情况下，所给药的细胞的性质可能与预期的不同。这种污染可能导致治疗失败，正如Vargas等人1在胰岛移植的情况下提出的那样。

没有太多的法规和指导文件专门针对细胞治疗的内毒素污染。美国食品药品监督管理局（FDA）文件《人类体细胞治疗和基因治疗指南》提出了几点。2内毒素检测要求与其他胃肠外产品的要求一致。在第III部分：细胞基因治疗产品的特性和释放测试中，法规指出最终产品和生产过程和使用的材料应经过QC测试。在“纯度"（B部分）标题下，该文件建议验证用于检测内毒素的合适的LAL测试方法。也就是说，必须证明所测试的细胞制剂不会干扰LAL测试检测内毒素的能力。该指南引用了美国食品药品监督管理局1983年的《鲎试剂裂解物试验验证指南》。第八节：“临床前评估……"未提及内毒素（LAL）检测或热原（兔子）检测。在这个阶段可能会考虑热原测试，但指南中没有说明。由于许多细胞疗法产生热原性细胞因子，热原检测呈阳性可能不表明内毒素污染。

欧洲药品评估机构（EMEA）于2001年发布了“关于人类体细胞治疗药品生产和质量控制的考虑要点"4。在标题“其他材料和试剂的来源和特性"下，声明“应确保辅助产品的低内毒素水平"。在给药之前，没有关于使用LAL的细胞治疗产品的释放测试的具体声明。

四、实际考虑

未稀释的细胞悬浮液可能会干扰光度法（比浊法和显色法）。因此，du Moulin和同事5使用凝胶凝块法检测外周血单核细胞，然后再将其送回患者体内进行自淋巴细胞治疗。这些作者对作为细菌污染指标的内毒素的潜力很感兴趣。在随后的一篇论文6 中，该研究小组介绍了一种光度（显色）测定法的验证情况。

不同类型的细胞制剂可能具有不同的干扰特性。此外，来自不同供体的相同类型的细胞制剂也可能具有不同的抑制（或增强）模式。为了解决这些可能的差异，方法开发应该产生一个坚固的测试，以便通过对干扰因素进行测试，可以对三个不同批次的治疗制剂（最好使用来自三个不同来源的细胞）进行测试验证。尽管尽了最大努力来开发一种坚固的测试，但可能仍然有必要在测试程序中建立灵活性，以克服来自麻烦样本的干扰。如果克服干扰需要改变样品的处理方式，则当超过原始验证的参数时，应对修改后的处理方式进行干扰因素测试。

另一个实际考虑因素是（1,3）-β-D-葡聚糖污染可能导致LAL检测结果假阳性（即无内毒素）。Anderson等人7报道了用于HIV免疫临床试验的自体树突状细胞LAL凝胶凝块试验呈阳性。在这种情况下，污染源被证明是硝酸纤维素过滤器。与内毒素一样，葡聚糖是生物反应调节剂，但在任何药典或监管文件中都没有对葡聚糖的限制。因此，葡聚糖有可能影响细胞疗法的性质和/或影响该疗法的接受者。FDA规定，LAL检测阳性（不合格）的结果必须被认为是不合格的，除非有其他证明。葡聚糖特异性LAL试剂（Glucatell，ACC目录号GT002）和葡聚糖特异性LA测试（使用Gluchield葡聚糖阻抑制冲液，ACC目录编号GB0051）可以帮助区分内毒素和葡聚糖污染。建议对纤维素过滤器进行葡聚糖测试，以避免LAL测试呈阳性以及葡聚糖对细胞的可能影响。

检测细胞疗法中的内毒素是具有挑战性的，因为所测试的材料可能随着供体的血液化学而变化。在对患者进行细胞治疗之前，执行LAL以提供结果的技术人员经常面临紧迫的时间压力。因此，重要的是，测试方法要坚固耐用，不易受到干扰，因为干扰会导致测试无效，需要重复测试。稀释样品的能力对于获得准确的内毒素检测结果至关重要。光度法明显比凝胶凝块法更灵敏，最大有效稀释倍数（MVD）也大大提高。因此，这些方法可以对样品进行更大程度的稀释，以克服干扰和减少悬浮细胞造成的浑浊。使用Pyros Kinetix® Flex96细菌内毒素定量检测系统的光度技术的仪器和试剂，在中国大陆可联系科德角国际购买美国ACC产品。Pyros Kinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统是可用的灵敏的内毒素检测系统，它提供了最大的MVD和稀释范围，以克服干扰。

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五、结论

适用于肠外产品或医疗器械内毒素检测的原则同样适用于细胞疗法。关于内毒素对接受者的影响也有类似的担忧，这推动了合规性要求。然而，活细胞治疗带来了额外的风险，即内毒素可能会影响细胞的特性及其治疗价值。由于这两个原因，细胞疗法的内毒素检测是非常重要的。由于内毒素可能会改变细胞的特性，强烈建议从潜在治疗研究的早期阶段开始监测内毒素污染。此外，对内毒素控制重要性的早期认识将确保在转移到cGMP生产过程中时，也会转移关于内毒素控制的适当考虑。

参考文献:

1.Vargas, Francesca ； Vives-Pi, Marta ； Somoza, Nuria ； Armengol, Pilar； Alcalde, Laura； Marti, Merce； Costa, Manuela； Serradell, Laurence； Dominguez, Orlando； Fernandez-Llamazares, Jaume； Julian, Joan F.； Sanmarti, Anna； Pujol-Borrell, Ricardo. 1998. Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. 65（5）:722-727.

2.“Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy." US. US Food and rug Administration, Rockville, MD, 1998.

3.“Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate test as an End- Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices." US Food and Drug Administration, Rockville, MD, 1987.

4.“Points to Consider on the Manufacture and Quality Control of Human Somatic Cell Therapy Medicinal Products." European Agency for the Evaluation of Medicinal Products （EMEA）, London, 2001.

5.du Moulin, G. C., Liu, V., and Osband, M. E. 1992. Limulus amebocyte lysate （LAL） assay in living cell therapies. Biopharm. 5: 32-54.

6.Pitkin, Zorina, Prakash Chhugani, Aaron Chenette, Yuan-Jin Shen, Gary C. du Moulin. 1996. Validation of an automated method of endotoxin testing for use in the end-product testing of ex vivo activated T-lymphocytes used in a somatic cell therapy. Biotechnology and Bioengineering, 50（5）: 541 – 547.

7.Anderson, J., M. Eller, M. Finkelman, D. Birx, S. Schlesinger-Frankel, M. Marovich. （2002）. False positive endotoxin results in a DC product caused by （1-->3）-beta-D-glucans acquired from a sterilizing cellulose filter. Cytotherapy. 4（6）:557-559.