内毒素的分离提取和纯化方法介绍

Boivin和Messrobeanu于1935年，将活菌或经冷冻干燥的大肠杆菌，在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸共同振荡或剧烈搅拌，将细菌细胞裂解，使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后，加2倍体积的冷冻乙醇，将生成的沉淀物溶解、浓缩后冷冻干燥，即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白，这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。

（二）酚-水法

wesphal和luederitz于1952年为分离含蛋白质较低的LPS而建立的方法，以后被广泛应用于水溶性S-LPS的提取。具体过程为：在细菌的水溶液中，加入等量90%的酚将细胞裂解，使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃，振荡10～15min后，冷却、离心，收集富含LPS的水相，并反复用水萃取3～5次，然后将水相浓缩、冷冻于燥，得到粗提的LPS，将粗制品溶解于水，高速离心（100000g，2～3h），得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻干燥。此法提取的LPS纯度较高，蛋白质含量为1%~3%。

由Galanos设计的提取R-LPS的方法。预先经乙醇、丙酮、乙-醚脱脂后的干燥菌，用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2～3次，取酚相，得到LPS和孔蛋白（porin）提取液，用减压法去除溶媒，加水形成沉淀，并洗涤3～5次，然后再用80%苯酚复溶，减压干燥，得到的LPS粗制品溶于水，超速离心取沉淀，即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS，不含核酸和多聚糖，蛋白质含量可控制在1%以下。

由Morrison等于1975年设计。水-丁醇法较酚法简便，温和，适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS；所得制品含蛋白量约1%。但此方法仍存在一些不足，由于丁醇不能灭活制品中酶类，导致在制备过程和储存时，Lipid A常发生降解。

二、纯化
 

（一）离子交换层析法

利用阳离子树脂非特异性的吸附带负电荷LPS的性质，将LPS从流动相中分离纯化出来。

利用多粘菌素B特异性结合LPS的特性，将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的表面，制成特异性结合LPS的层析柱，即可对LPS进行亲和层析法纯化。

通常情况下，未提纯的LPS溶液中存在大量的小分子带电物质，如Mg²⁺ 、Ca²⁺和少量的Fe²⁺ 、A1³⁺、Zn²⁺、Na⁺等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团，使得本可以用带电荷的吸附剂将LPS除去的效果明显降低。电透析便是通过离子交换的方法进行LPS纯化的。其原理就是将很多的阴/阳离子交换膜交错地串联在一起，电解质溶液则在膜间流动，两侧施加直流电之后溶液中阳离子（如无机阳离子、生物碱等）向阴极移动而阴离子（如无机阴离子、有机酸等）向阳极移动。其中阴离子可顺利通过阴离子膜，但再往前移动时却被邻近的阳离子膜挡住。同样，阳离子也可以顺利地通过阳离子膜而无法通过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中，最终得到纯化的提取物（图2-6）。

由于提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质，因此在LPS的电透析过程中可发现阴极的pH值升高，阳极的pH值变化不明显的现象。电透析过程中LPS溶液的pH值常有一定程度的下降，同时由于有稳定LPS多聚体功能的Mg²⁺ 、Ca²⁺等离子成分被除去，LPS多聚体变为单体而发生沉淀。为避免此现象，需用NaOH或三乙胺将其中和到pH 7.0左右，使其形成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而重新溶解。电透析结束时，LPS一般为酸性产物，此酸性LPS在水中的溶解度极低，可直接进行冻干处理，-4～-20℃低温保存，每次使用前可用不同的碱中和转化成所需要的LPS盐。

根据LPS与核酸片段在分子量上的差异，可用超速离心法、电泳法等方法将其去除。