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内毒素的分离提取和纯化方法介绍

发布时间: 2024-01-11  点击次数: 108次
从20世纪30年代至今根据内毒素的理化性质而设计的分离、鉴定内毒素的技术方法主要有下述几种

一、分离提取

(一)三氯醋酸法

Boivin和Messrobeanu于1935年将活菌或经冷冻干燥的大肠杆菌在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸共同振荡或剧烈搅拌,将细菌细胞裂解使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后加2倍体积的冷冻乙醇将生成的沉淀物溶解、浓缩后冷冻干燥即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白,这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。

(二)酚-水法

wesphal和luederitz于1952年为分离含蛋白质较低的LPS而建立的方法以后被广泛应用于水溶性S-LPS的提取。具体过程为在细菌的水溶液中,加入等量90%的酚将细胞裂解使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃,振荡10~15min后冷却、离心收集富含LPS的水相并反复用水萃取3~5次然后将水相浓缩、冷冻于燥得到粗提的LPS将粗制品溶解于水,高速离心100000g2~3h),得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻干燥。此法提取的LPS纯度较高蛋白质含量为1%~3%。

(三)酚-氯仿-石油醚法

由Galanos设计的提取R-LPS的方法。预先经乙醇、丙酮、乙-醚脱脂后的干燥菌用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2~3次取酚相得到LPS和孔蛋白porin提取液用减压法去除溶媒加水形成沉淀并洗涤3~5次然后再用80%苯酚复溶减压干燥得到的LPS粗制品溶于水超速离心取沉淀即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS不含核酸和多聚糖蛋白质含量可控制在1%以下。

(四)水-丁醇法

由Morrison等于1975年设计。水-丁醇法较酚法简便温和适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS所得制品含蛋白量约1%。但此方法仍存在一些不足由于丁醇不能灭活制品中酶类导致在制备过程和储存时,Lipid A常发生降解。

二、纯化
 

(一)离子交换层析法

利用阳离子树脂非特异性的吸附带负电荷LPS的性质将LPS从流动相中分离纯化出来。

(二)亲和层析法

利用多粘菌素B特异性结合LPS的特性将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的表面制成特异性结合LPS的层析柱即可对LPS进行亲和层析法纯化。

(三)金属离子和小分子量多胺成分的去除

通常情况下未提纯的LPS溶液中存在大量的小分子带电物质如Mg2+ 、Ca2+和少量的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团使得本可以用带电荷的吸附剂将LPS除去的效果明显降低。电透析便是通过离子交换的方法进行LPS纯化的。其原理就是将很多的阴/阳离子交换膜交错地串联在一起电解质溶液则在膜间流动两侧施加直流电之后溶液中阳离子如无机阳离子、生物碱等向阴极移动而阴离子如无机阴离子、有机酸等向阳极移动。其中阴离子可顺利通过阴离子膜但再往前移动时却被邻近的阳离子膜挡住。同样阳离子也可以顺利地通过阳离子膜而无法通过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中最终得到纯化的提取物图2-6)。

由于提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质因此在LPS的电透析过程中可发现阴极的pH值升高阳极的pH值变化不明显的现象。电透析过程中LPS溶液的pH值常有一定程度的下降同时由于有稳定LPS多聚体功能的Mg2+ Ca2+等离子成分被除去LPS多聚体变为单体而发生沉淀。为避免此现象,需用NaOH或三乙胺将其中和到pH 7.0左右使其形成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而重新溶解。电透析结束时LPS一般为酸性产物此酸性LPS在水中的溶解度极低可直接进行冻干处理,-4~-20℃低温保存每次使用前可用不同的碱中和转化成所需要的LPS盐。

(四)核酸成分的去除

根据LPS与核酸片段在分子量上的差异可用超速离心法、电泳法等方法将其去除。


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