血液样本细菌内毒素检测为何难？多重干扰和解决方法一次说清！

在生物医学和制药领域，准确检测血液样本中的细菌内毒素含量对于疾病诊断、药物安全性评估等工作是非常重要的。然而，在利用鲎试剂（LAL）对血液样本，包括全血、血清、血浆及其成分进行检测分析时，往往面临诸多挑战，堪称最难处理的样本类型之一。

一、血液样本检测干扰因素剖析

血液是一种极其复杂的生物组织，存在多种物质，会对鲎试剂检测造成干扰。

（一）蛋白质的中和作用

部分血液蛋白质能够中和细菌内毒素，当采用鲎试剂对血液样本进行定量测定内毒素浓度时，这些蛋白质会与细菌内毒素结合，给检测结果带来误差。

（二）丝氨酸蛋白酶的干扰

血液中含有的丝氨酸蛋白酶，也会干扰鲎试剂检测过程。这些蛋白酶呈现出两种不同的干扰形式：其中一些蛋白酶会降解鲎试剂酶级联反应中的蛋白质，导致出现抑制反应；另一些则会激活该级联反应，导致出现假阳性结果。

（三）（1,3）-β-D-葡聚糖的影响

正常血液中除蛋白质外，还含有少量（1,3）-β-D-葡聚糖。这种物质是真菌细胞壁的成分，会激活LAL酶级联反应。真菌感染会导致（1,3）-β-D-葡聚糖水平升高，即便其含量较低，若使用对（1,3）-β-D-葡聚糖敏感的LAL试剂检测细菌内毒素，也极易出现假阳性结果。

（四）样本的复杂性与个体差异

此外，血液化学成分复杂多变，受患者或捐献者生理状态的显著影响。而生理状态又受制于年龄、饮食、基因构成、健康状况、疲劳程度、生活方式等诸多因素。因此，即便某种处理方案对多数样本有效，仍可能存在部分样本无法有效克服干扰的情况。

二、样本处理的策略选择

虽然通常需要对样品进行一定处理，但在实施任何灭活操作前，建议先对样品进行检测。不同样品的干扰程度因样本而异，且与检测时的稀释度相关，有时甚至无需处理。与许多干扰LAL测试的样品类似，对血液或血清样本而言，稀释样本直至干扰消除，往往是较为有效的检测方法。当然，通过处理样品来中和干扰因素也具有可行性，有多种处理手段能够使引起干扰的蛋白质变性或失去活性。

（一）热灭活法

热灭活法是首先值得尝试的处理方式，该方法不仅效-果-显-著，操作也相对简便。不过，在某些情况下，热灭活可能会影响细菌内毒素的表观浓度，因为加热会增强某些蛋白质与细菌内毒素的结合程度。为验证热灭活法的有效性，可以分别检测经过热灭活处理和未处理的样本，并对比两者结果。

（二）化学处理法

除热灭活法外，还有一些化学处理手段，如添加酸或氯仿等，但这些方法仅在热灭活无效时推荐使用。实践表明，硝酸、洗涤剂、氢氧化钠等处理方式，能够有效降低各类全血样本中的干扰。无论采用何种处理方法，每个检测样本都必须设置阳性产品对照，这一点至关重要。

三、试剂优化与检测方法的匹配

在血液或血清样本的细菌内毒素检测中，需注重试剂与检测方法的协同优化以确保结果可靠性。

（一）试剂优化应对葡聚糖干扰

针对样本中（1,3）-β-D-葡聚糖对检测的干扰问题，科德角国际合作企业美国ACC（Associates Of Cape Cod）公司推出的Glucashield®葡聚糖抑制缓冲液提供了有效解决方案。该缓冲液可与其全系列LAL试剂（涵盖Pyrotell®凝胶法鲎试剂、Pyrotell®-T浊度法鲎试剂、Pyrochrome®显色法鲎试剂及Chromo-LAL显色法鲎试剂）实现精准适配。

▲Glucashield®葡聚糖抑制缓冲液

Glucashield®葡聚糖抑制缓冲液的作用机制是通过特定的化学物质与（1,3）-β-D-葡聚糖结合，屏蔽葡聚糖对酶联反应的干扰，显著提升细菌内毒素检测特异性，避免因葡聚糖引发的假阳性结果，使检测结果更真实地反映细菌内毒素水平。

（二）检测方法的选择与优化

不同检测方法的适用性需根据样本特性进行选择。

1、凝胶法：凭借高稳定性和抗干扰能力，成为复杂生物样本检测的首-选方案，它通过观察鲎试剂与细菌内毒素反应形成凝胶的情况来判断细菌内毒素的存在与否及大致含量。在血液样本检测中，即使样本存在一定程度的干扰物质，凝胶法也能相对稳定地呈现检测结果。

2、显色法：虽具备操作便捷性，但需警惕血浆/血清在405nm波长下的光学干扰。对此，采用含有重氮基连接的Pyrochrome®显色法鲎试剂，通过生成540-550nm吸收波长的显色产物，可有效规避干扰。但需要注意的是，该方法属于终点检测，相比动力学方法，其检测范围较窄。

3、光度法（含显色/浊度法）：实施光度法（含显色/浊度法）检测全血样本时，为避免血细胞造成的光学干扰，通常需要先对样本进行离心处理。在实际操作中，光度法可能从多个稀释度的检测结果中得出有效数据，即阳性产品对照“加标"回收率在规定范围内，且样品检测结果处于标准曲线范围内。

然而，经常出现这样的情况：尽管不同稀释度下的加标回收率一致，但经稀释校正后的细菌内毒素浓度，会随着未加标样品稀释程度的变化而改变，且浓度往往随稀释而升高。这表明，即便加标回收率显示无干扰，但样品中实际测得的细菌内毒素情况说明干扰依然存在，添加的加标细菌内毒素与样品中的细菌内毒素表现存在差异。此时，可通过逐级稀释直至加标/未加标样本浓度趋于一致；若稀释无效，则必须探索其他处理方法来克服干扰。在没有其他有效处理手段的情况下，合理的做法是将检测结果报告为“大于或等于检测到的最高细菌内毒素浓度"。

四、综合策略与技术支持

血液及血液衍生样本在鲎试剂（LAL）检测中常因干扰因素面临挑战，需通过系统的方法开发确定适宜检测技术。尽管存在多种抗干扰策略，但优先选用简单且经过验证的方法更为高效，其推荐顺序依次为稀释法、热失活法和化学处理法。此过程中，专业技术支持对检测方案的成功至关重要，需结合样本特性深度分析及方法学验证，以确保结果可靠性。