内毒素与鲎试剂的反应原理

鲎系海产动物，生物学分类上属节肢动物门肢口纲剑尾目。在其血液中含有一种特殊的变形细胞（amoebocyte）。这种变形细胞中含有能被内毒素激活的C因子、B因子、前凝固蛋白，因此，内毒素检测LT法（鲎变形细胞溶解物试验）的机理即是内毒素通过激活C因子、B因子、前凝固酶，而使可凝固蛋白变成凝固蛋白（肉眼可见的凝胶），从而可以半定量及定量地测知内毒素的含量（图1）。

日本学者在对可凝固蛋白氨基酸顺序研究的基础上，发现内毒素激活的凝固酶的作用点为可凝固蛋白的第18（Arg）和19（Ghr）间的肽健，以及第46（Arg）和47 （G1y）间的肽键，而裂解为A链、B链及C肽。且在切断部位的羧基端氨基酸的结构均为-G1y-Arg，提出此酶的作用有特异性（图2）。产色基质内毒素检测法即是据此原理而设计的。

一般地讲，内毒素与鲎试剂的反应是非常特异的，因此，LT法的假阳性极少。从革法兰氏阳性菌分离出的肽聚糖虽亦能凝固鲎试剂，但其活性比内毒素低1000~ 400000倍。

近来发现一种新的合成抗癌剂羧甲基（1→3）-β-D-葡聚糖亦能与鲎试剂起反应。其反应原理是：鲎试剂中含有一种称为G因子的物质，此抗癌剂能激活鲎试剂中的G因子，而活化的G因子又依次激活前凝固酶、可凝固蛋白，从而形成凝胶（图2）。至此凝血酶、凝血激酶，Poly I:CPo1yA:U、核糖核酸酶、胰蛋白酶等，亦可凝固鲎试剂而引起假阳性反应。但用氯仿处理此等物质（浸取3～4小时）可以除去这些物质，从而可避免发生假阳性反应。

哺乳类动物血浆中含一种酯酶，它对内毒素有降解及脱毒的作用，故用LT法检测血浆中的内毒素易受此种物质的影响，而造成假阴性结果。为了避免此等因素的影响，在试验前血浆需经过特殊处理。目前共有下述四种方法处理血浆，即稀释加热法、酸化值液、氯仿浸取法及凝胶过滤法。我们及其它的一些工作者认为稀释加热法简便易行，效果较好。

在鲎血液中，还有一种称之为抗LPS因子（Anti - LPS - factor，ALF）的蛋白物质，分子量约为15KDa，为一种鲎血抗凝剂，对LPS介导的LT反应有直接的抑制作用。ALF可抑制LPS对LT反应的初始.阶段。因此在制备鲎试剂时，应将此物质清除。氯仿浸取法可有效去ALF。除去ALF及加入Ca++ （o.o2M）可改善鲎试剂的质量，提高敏感性约100倍。