鲎试验法中鲎试剂及内毒素的标化问题

一、鲎试剂的标化问题

鲎试剂为鲎变形细胞的细胞溶解物，制备时可采用裂解法和机械方法使细胞破裂。鲎试剂的敏感性可受到动物个体差异、季节差异及生产工艺过程中不稳定因素的影响。因此各批次间，其敏感性差异很大。即使是同一批试剂，由于操作、保存方法、环境因素等影响，其敏感性亦不一样。鲎试剂在液态时极不稳定，往往很难保存。贮存于4 ℃冰箱，其活性一般于4~5月开始下降，8个月左右*失活。冷冻保存的稳定性稍高于液态保存。`真空冻干粉剂保存为目前最-好的方法，- 30℃保存其有效期可达2年。

改善生产工艺，控制制剂中的参数，可使试剂的敏感性和稳定性增高。国内丁友玲等报道，鲎试剂含水量控制在5%以下，总蛋白量控制在5mg/ml以上，Ca⁺⁺、Mg⁺⁺控制在0.01~0.1M，可使鲎试验的稳定性提高，重演性增强。

试验前，应以WHO标准内毒素作标定，如试剂敏感性为1ng/ml或小于1ng /ml，则认为是敏感的，可以应用。美国制备了参考鲎试剂，各种鲎试剂在应用前与其比较，可获得相对效力。

除应解决好鲎试剂的标化问题外，对鲎试剂的操作程序亦应标化，因为操作上微小的差异即可使试剂的敏感性改变。

二、内毒素的标化问题

从各种细菌制备的内毒素，或以同一种细菌制备的内毒素，或内毒素批次间、批次内，其活性均可不一致。所以应用LT法（鲎试验法，Limulus test）检测内毒素时，需要一个标准的内毒素作为对照参比。

大肠杆菌内毒素在各种细菌内毒素的LT反应上处于中值的位置（图4），且其稳定、可溶，因此将大肠杆菌内毒素作为参考标准内毒素(Reference Standar d En-dotoxin，RSE)是较为适宜的。

根据以上理由及原则，美国FDA下属的生物制品管理局(BOB)组织了大规模的研究。制备了一系列标准参考内毒素（表4）。分别命名为16、EC、EC-1，EC-2………，EC-5。其中EC-2是以大肠杆菌O₁₁₁B₄。(Braude株）提取的，各项指标均为满意。

日本从大肠杆菌UKTB中提取了内毒素，作为日本的标准参考内毒素，采用酚水抽提法，然后再用乙醇沉淀。化学分析、热原性及鲎试剂激活性*符合RSE的标准。且其在干燥状态下稳定性极-好，可长期应用，但如溶于水，则稳定性可下降。

最近美国药品部门已向WHO提供了一批新的RSE，供国际上检测时作为参比用，这使LT试验结果容易统一。实际上WHO对此早就组织了合作研究，包括多种鲎试剂及内毒素。

从理论上讲，一种RSE需满足下述条件：①干燥制剂；②在性质是可用的；③在室温下稳定；④吸湿性少；⑤易溶于水；⑥在水及生理盐水中清澈；⑦可致家兔及人反应；⑧须从常见的菌株提取。

但目前所有RSE均不*符合上述条件，因此，有关内毒素的标化问题仍须进行深入的研究。

具体检测时，各实验室可采用对照标准内毒素（Control Standard Endotoxin，CSE)，但其效能必须先以RSE进行标定。CSE效能的计算公式为:

CSE效能=GM比值×E  Eu/μg

其中GM比值为算术平均值，E为RSE的效能，常为6000Eu/管，CSE与 RSE作平行的LT试验，试管数N应大于16，然后算出CSE与RSE相应的比值R₁，R₂，……R_N，将这些比值换算成以10为底的对数值，然后计算平均和标准的SD，平均SD的反对数即为GM比值。

1981年9月美国、日本、英国、西德、瑞典、意大利六国学者及监定部门的代表在美国Woods Hole 海洋学院召开了用于注射用品的鲎试剂和内毒素标准的国际会议，会上Difco实验室的Fleishman报告了“自多种革兰氏阴性菌内毒素的LT法检测热原的比较”一文，提出了被检内毒素相对活力的概念，即与参考标准内毒素（EC-2）比较后的相对活力，计算公式如下图:

其中5 Eu/ng是FDA标准内毒素EC-2的指-定活力。