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鲎试验法中鲎试剂及内毒素的标化问题

发布时间: 2022-08-31  点击次数: 61次

一、试剂的标化问题

试剂为变形细胞的细胞溶解物,制备时可采用裂解法和机械方法使细胞破裂。试剂的敏感性可受到动物个体差异、季节差异及生产工艺过程中不稳定因素的影响。因此各批次间,其敏感性差异很大。即使是同一批试剂,由于操作、保存方法、环境因素等影响,其敏感性亦不一样。试剂在液态时极不稳定,往往很难保存。贮存于4 ℃冰箱,其活性一般于4~5月开始下降8个月左右完全失活。冷冻保存的稳定性稍高于液态保存。`真空冻干粉剂保存为目前最-好的方法,- 30℃保存其有效期可达2年。

改善生产工艺,控制制剂中的参数,可使试剂的敏感性和稳定性增高。国内丁友玲等报道,试剂含水量控制在5%以下,总蛋白量控制在5mg/ml以上,Ca++、Mg++控制在0.01~0.1M,可使试验的稳定性提高,重演性增强。

试验前,应以WHO标准内毒素作标定,如试剂敏感性为1ng/ml小于1ng /ml,则认为是敏感的,可以应用。美国制备了参考试剂,各种试剂在应用前与其比较可获得相对效力。

除应解决好试剂的标化问题外,对试剂的操作程序亦应标化,因为操作上微小的差异即可使试剂的敏感性改变。

二、内毒素的标化问题

从各种细菌制备的内毒素,或以同一种细菌制备的内毒素,或内毒素批次间、批次内,其活性均可不一致。所以应用LT法(鲎试验法,Limulus test)检测内毒素时,需要一个标准的内毒素作为对照参比。

大肠杆菌内毒素在各种细菌内毒素的LT反应上处于中值的位置(图4),且其稳定、可溶,因此将大肠杆菌内毒素作为参考标准内毒素(Reference Standar d En-dotoxin,RSE)是较为适宜的。

根据以上理由及原则,美国FDA下属的生物制品管理局(BOB)组织了大规模的研究。制备了一系列标准参考内毒素表4)。分别命名为16、EC、EC-1EC-2………,EC-5。其中EC-2是以大肠杆菌O111B4。(Braude株)提取的各项指标均为满意。

日本从大肠杆菌UKTB中提取了内毒素,作为日本的标准参考内毒素,采用酚水抽提法,然后再用乙醇沉淀。化学分析、热原性及鲎试剂激活性完全符合RSE的标准。且其在干燥状态下稳定性极-好可长期应用,但如溶于水,则稳定性可下降。

最近美国药品部门已向WHO提供了一批新的RSE供国际上检测时作为参比用,这使LT试验结果容易统一。实际上WHO对此早就组织了合作研究,包括多种试剂及内毒素。

从理论上讲一种RSE需满足下述条件①干燥制剂②在性质是可用的③在室温下稳定④吸湿性少⑤易溶于水⑥在水及生理盐水中清澈⑦可致家兔及人反应⑧须从常见的菌株提取。

但目前所有RSE均不完全符合上述条件,因此,有关内毒的标化问题仍须进行深入的研究。

具体检测时,各实验室可采用对照标准内毒素(Control Standard EndotoxinCSE),但其效能必须先以RSE进行标定。CSE效能的计算公式为:

CSE效能=GM比值×E  Eu/μg

其中GM比值为算术平均值,E为RSE的效能常为6000Eu/管,CSE与 RSE作平行的LT试验试管数N应大于16然后算出CSE与RSE相应的比值R1R2……RN,将这些比值换算成以10为底的对数值,然后计算平均和标准的SD,平均SD的反对数即为GM比值。

1981年9月美国、日本、英国、西德、瑞典、意大利六国学者及监定部门的代表在美国Woods Hole 海洋学院召开了用于注射用品的试剂和内毒素标准的国际会议会上Difco实验室的Fleishman报告了“自多种革兰氏阴性菌内毒素的LT法检测热原的比较”一文,提出了被检内毒素相对活力的概念,即与参考标准内毒素EC-2比较后的相对活力,计算公式如下图:

其中5 Eu/ng是FDA标准内毒素EC-2的指-定活力。

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