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细菌内毒素(脂多糖)提取法之三氯醋酸法及酚水法的介绍

发布时间: 2022-09-08  点击次数: 69次

内毒素系革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)成分。在维持外膜的结构、通透性以及临床阴性菌感染中均起着重要的作用。以化学方法提取的LPS注射动物能重复革兰氏阴性菌感染期间所出现的多种病理反应,故实验动物应用提取的LPS可更好地了解LPS的致病作用并寻找可能的防治对策。

 

 

一、三氯醋酸法(Trichloroacetic Acid,TCA)

 

TCA法是Boivin等(1933)首先应用的,借助0.25N TCA,在4℃可将LPS从湿菌或经丙酮干燥的细菌中提取出来,加入2倍体积的冷乙醇即可取得LPS的沉淀物。用这种方法提取的产物,严格地讲是一种LPS-蛋自质复合物,这种复合物即方早期所称的Boivin抗原。TCA法提取的LPS产量较高,具有很好的抗原性,对O特异性侧链抗体有血清学特异反应,可结合补体和致敏红细胞,分子量达几百万,但蛋白质含量很高,故纯度较差。目前这一方法已较少使用。

 

二、酚水法

 

这一方法是Westphal等于1952年提出的,该法是目前应用最-广泛的方法。酚水法主要用于S型细菌LPS的提取,亦可用于R突变型细菌LPS的提取,但产量稍低。酚水法提取液所含的苯酚与水的比例是45 : 55。当提取液加热至68℃并维持5分钟时,苯酚和水形成了一个单一的相,冷却至4℃后,形成了两个相,分别为苯酚相(被水饱和)和水相(被苯酚饱和)。核酸、多糖及LPS大部分溶解于水相中,而大部分蛋白质溶解于苯酚相中,不溶性物质沉淀在两相交界处。

 

含LPS的水相经吸取、透析<去除苯酚)并干燥后即为LPS的粗制品。LPS粗制品经超离心1000000×g,可得到精制的LPS。精制后的LPS,尚含有多糖成分及与其共价结合的类脂体A成分、小量的肽(1~3 %)。这种提取物对人、兔的抗原较弱,但能展示O特异性侧链抗原反应。内毒素毒性较强,致敏红细胞不明显,能结合补体,分子量有几百万。产量仅1~4 %(占干菌重)。

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