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细菌内毒素(脂多糖)的提取之PCP法、高压超声处理法及DMSO法的介绍

发布时间: 2022-09-09  点击次数: 112次

一、苯酚╱氯仿╱石油醚法PCP


LPS分子镶嵌于胞壁的外膜中,用某些化学试剂将胞壁裂解(如酚)后LPS分子从破溃的胞壁中游离出来。由于LPS是一种两性分子,故它们在不同溶剂中的溶解度,完全取决于该分子上的亲水/疏水性基团多少。S-LPS有完整的亲水性О特异性侧链所以SLPS属亲水性分子。而RLPS,缺乏O特异性侧链,含有完整或不完整的核心多糖和完整的类脂A,亲水度不大,而易溶于有机溶剂中,故而R-LPS用酚水法提取时所得的产量极低。


PCP法是以90%苯酚、氯仿及石油醚406025:8所组成的单相混合提取液,这一提取方法只能将LPS及与之紧密结合的透道蛋白Porin提取出来,而其它成分则排除在提取液外。PCP法的水沉淀步骤仅能使LPS发生沉淀,而透道蛋白仍溶于苯酚中故而PCP法所提取的LPS是一种较为纯化的制剂。


PCP法对制取R型细胞的LPS产量十分满意,且无核酸污染,蛋白质含量也仅在0.11 %间,该法温和,在室温520℃即可完成制取周期较短,适用于从RaRe的细菌,可成功地提取R-LPS产量也相当高。故PCP法是研究R-LPS的有用方法。应必须注意的是在PCP法中,每一步操作均不应使用盐类,如MgCl2CaCl2,否则会严重影响产量。



二、高压超声处理法


以某些物理方法(如超声波处理菌体细胞使其完全破裂可增加继后提取方法的完全性,从而可使LPS的产率增加。Richard1983研制了一种既可提取光滑型又可提取粗糙LPS的新方法。该方法采用了高压处理15000Ib/in2细菌的方法,粉碎菌细胞继又用超声波处理,促进碎片完全裂解,再以DNa s eRNa s e处理,消化核酸。再加入蛋白酶去消化蛋白质,离心12000xg,浓缩干燥。如此制得的LPS产量为菌体的5181%(按测脂肪酸、糖和KDO),蛋白质为0.1%、核酸1 %25%,纯度较高,产量比酚水法高7倍,比PCP法高2倍。


所得LPS经各种免疫化学分析,均提示用此方法提取的LPS其抗原结构完整。其不足之处是碱性条件上的加热以前认为这一处理在于除掉蛋白质,特别是对于有些细菌如绿脓杆菌有用,但对别的细菌恐属多余。应当指出的一点是,碱性加热条件使类脂体A上的脂肪酸酯降解。另外个不足之处是,此方法较为复杂,不易被一般实验室采用。


三、DMSO


Adams介绍了一种较为简单的LPS提取方法。该法应用二甲亚Dimethyl SulfoxideDMSO作为主要提取试剂。以胞壁原料提制LPS。主要步骤为将预先制取的干燥胞壁以60DMSO提取水洗,酸化丙酮处理,冷冻干燥。DMSO法提取的LPS产量是酚水法的10倍,但蛋白质含量很高45%) 。


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