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选择性清除内毒素的方法:吸附技术之亲和吸附

发布时间: 2023-09-11  点击次数: 302次

通过内毒素选择性亲和吸附剂来清除内毒素应该是可能的,并能保证蛋白质几乎100%回收。为了清除不同细菌和菌株来源的内毒素,所采用的吸附剂必须与内毒素的化学结构能较好地匹配,所以应选用针对内毒素共有基团的选择性亲和配体,以识别内毒素的保守结构成分,这对于那些未知种类的内毒素大多也是可以成功的。

9.4选择性清除内毒素的方法:吸附技术之亲和吸附.png

1.多黏菌素B

多黏菌素B的抗菌活性针对革兰阴性细菌,通过插入细菌的细胞壁,降解破坏细菌胞壁,其表面的活性环行肽能打破内毒素聚合物。由于多黏菌素B和脂质A之间能相互作用,所以它是一个能识别不同来源内毒素的基团选择性配体。在各种被污染的革兰阴性细菌培养滤液中(110mg/L),用多黏菌素B作为吸附配体,清除因素超过105TalmadgeSiebert对此进行了分批试验,结果显示在有10g/LBSA或人IgG存在情况下输入6000~6700EU/ml(≈0.60.7mg/L)浓度的内毒素,使接触时间为16h,其清除因素大约为103左右,且只能在此水平上下轻微改变。而对不同的单克隆抗体溶液,内毒素的清除因素明显不同。如抗马过氧化物酶抗体和抗人绒毛膜促性腺激素抗体(浓度分别为2.1g/L20EU/ml内毒素和0.5g/L61EU/ml内毒素),在20mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中,内毒素分别被清除到0.3EU/ml6EU/ml,清除因素分别约为10010

有研究者报道,从小牛过氧化氢酶中清除内毒素的清除因素超过1000。内毒素血症患者的血浆也可以用此方法,洗脱下来的物质主要是具有神经毒性和肾毒性的多黏菌素B以及单核细胞刺激释放的IL-1。此外,在流经多黏菌素B层析柱时蛋白质也会丢失,比如过氧化氢酶丢失24%BSA丢失20%。这是由于这些配体具有阳离子特性而与带负电荷的蛋白质发生电荷间相互作用的结果,这也是为什么即使从DNA质粒预备物中可去除20010000倍的内毒素而DNA的回收率却仅约50%的原因。

2.组胺和组胺酸

早在1968Kanoh等就曾将组胺和组胺酸用作了配体,他们发现,核苷酸和内毒素间有相互作用。后来,在1982年,Minobe等也发现除腺嘌呤、胞喀啶等核苷酸碱基外,组胺和组胺酸也能同样成功地使内毒素从各种微生物培养过滤液中去除。虽然,组胺是一种良好的吸附剂,但它们随后转变成组胺酸时才真正具备生物活性。组胺和组胺酸用作内毒素的吸附剂与多黏菌素B同样能有效对各种蛋白质溶液进行去污染,包括血清白蛋白、胰岛素、溶菌酶、肌红蛋白和另外一些清除因素在5200(主要因蛋白质含量和环境条件而异)之间的物质。

1990年,Matsumae等报道了有关分别检测产物回收情况和内毒素去除情况的数据,发现在与多黏菌素B同时存在时,不能很好地独立检测到蛋白质的恢复和内毒素的去除情况。其他实验室的数据显示,蛋白质的存在对于内毒素的去除有很大的影响,比如在有BSA存在的时候,内毒素的清除因素减少超过10倍以上;在有鼠IgG1PI=5.5)存在的情况下,如果是在中性环境里,清除内毒素根本就无效。同样,缓冲盐溶液对清除效果也是有一定影响的。

Minobe等采用了各种配体进行内毒素的清除,虽然它们的去除效果相似,但化学结构却十分不同。他们认为,内毒素结合的机制可归因于疏水作用和电荷作用的协同,主要是具有腔隙(space)的二氨乙烷(DAH)和咪唑的作用。组胺和组胺酸在这种吸附功能下并不必要。DAH腔隙自身也是有效的吸附物质,在一种以聚乙烯醇(PVA)为基础的膜系统支持下,对含有1130EU/ml内毒素的10%细胞色素c溶液和含85EU/ml内毒素的20%HAS溶液去污染,内毒素分别被去除5000倍和100倍。另外,有人也证实DAH和其他一些二氨链烷类对内毒素的有效吸附是由于离子间作用和疏水作用协同起作用的,但他们没有提供有关从蛋白质溶液中清除内毒素的数据。Petsch等于1997年发现,组胺酸配体的功能与其咪唑环上所带的正电荷有关。如果在一个不带正电荷的环氧乙烷谙腔隙混合情况下,只有在pH值≤5的时候才有明显的清除效果,此时咪唑环已被解离(pKI=6.0)。

3.多阳离子配体

从分子动力学方面来看,与蛋白质相比,有三维结构的内毒素是相当稳定的,这在吸附过程中起到关键性的作用。有资料显示,虽然吸附在0.5mol/LNaCl溶液中被有效抑制,但仍有一小部分内毒素在高盐浓度环境下(浓度>1mol/LNaCl溶液)被吸附。配体和内毒素由于长距离的电荷作用而随后产生短距离的相互作用是可能发生的。次级结合是在内毒素改变结构以适合于吸附剂表面的超微结构后通过另外的范德华力和氢键而实现的。用作内毒素吸附的吸附剂只有在某种严格的条件下(30%的乙醇加上1mol/LNaOH)才能成功地被清洁。这一点提示,在亲和配体和内毒素之间准确的结构匹配并不必要。由此可见,内毒素选择性配体应与多离子分子疏水部分的特性相符合。

事实上,一些阳离子多聚体已成功地被用作配体(如图35-2)。Mitzner等采用聚乙二胺(PEI)固定在纤维素小滴上,在体外从血清中清除内毒素,与多黏菌素B在生物超级相容性方面有相似的作用。与组胺不固定的纤维相比,PEI不固定在纤维素上,故可较多地从BSA溶液中去除内毒素,此时对离子作用力的依赖较少。肌球蛋白、γ球蛋白和细胞色素c溶液几乎能完-全清除内毒素(达95%以上),最终内毒素仅留下≤0.05μg/L,同时有98%的蛋白质可被保存下来。

9.4内毒素配体.png

与配体组胺、组胺酸、多黏菌素BDEAE在一个较高的蛋白质保存水平上相比,多聚L-赖氨酸(PLL)表现出略好的从BSA溶液中清除小量内毒素的能力。与DEAE离子交换相比,PLL吸附剂在蛋白质结合能力耗尽之后仍是有用的。与多聚L-组氨酸(PLH)和多黏菌素B相比,用高相对分子质量的PLL(相对分子质量为150000~300000)预包裹的微板能更好地促进与内毒素的结合。

最近,Hirayama等进一步将PLL引入一种多聚基质中从而改变常规用的多聚基质,他们认为可能有更好的效果。Karl等报道,无镐固定的PLH比表面固定有镐的PLH更能促进从BSA溶液中去除内毒素。PLH是一种相当昂贵的配体,在碱性环境(O.1mol/LNaOH)下不稳定。

多阳离子与内毒素间相互作用的原理可能与细胞和细胞碎片间的絮凝作用相类似。在絮状沉淀反应开始时,多阳离子-多阴离子复合物形成,然后进行水分子的替代,最后形成絮状物,这个过程也被称为复杂凝聚。如果这个过程也发生于不固定的多聚阳离子和内毒素时,复合物也会从溶液中析出来。这就解释了在这些吸附剂和选择性阳离子配体蛋白质的热力学实验中观察到的其结合位点的高亲和力现象。

4.具有阳离予功能基团的聚基质

Hirauyama等用了三年的时间发现通过球形多孔的聚γ-甲基-L-谷氨酸作为吸附剂比以组胺酸和聚氨基葡萄糖为基础的市售内毒素吸附剂有更强的内毒素结合能力而且较少依靠离子力工作范围也相应增加至0.4mol/LNaCl),并对BSA的选择性更好。此外通过改变反应条件而形成带有小孔的珠状形式可以阻止蛋白质渗透至孔系统这样便可获得高回收量的带负电荷网的蛋白质同时内毒素也被强力吸附。作者由此得出结论高效的内毒素清除能力是由于内毒素聚合物牢固地吸附于吸附剂表面BSA与吸附剂的结合能力相当低所致。

带电荷的功能性基团固定于侧链上使得酯键的化学活性不稳定是相当不利的所以原位清除CIPpH值高或低的情况下都不适合。NN-二甲胺丙-腈/N-丙烯胺的应用是近年来新兴起的。改变这两种单体的比例可以调节电荷的密度或者改变珠形物的孔径都是对内毒素的清除有利的。在溶液pH=7μ=0.05的条件下通常内毒素的去除可以达到96%99%0.5g/L BSA中的残余内毒素的量小于1EU/ml肌球蛋白、γ球蛋白和细胞色素c和其他蛋白质的恢复率达到或超过99%

配体固定于微滤过膜也能形成带阳离子功能基团的多聚体膜的内侧面通常是流经孔的壁最初被一个亲水多聚物如右旋糖苷、羟基纤维素或聚乙烯醇等覆盖。然后小配体如组胺酸、脱氧胆酸、多黏菌素BDEAE或者是多阳离子配体如PLLPEI在亲水的多聚物网中失去活动性。整个网络就如阳离子多聚体一样工作配体相对分子质量的高低并不十分重要。虽然这些膜吸附剂具有阳离子特性能够吸附带阴离子网的蛋白质,但是在蛋白质结合能力耗尽之后并未发现与配体PEIPLL甚至DEAE所结合的内毒素被取代下来。相应的吸附等温线显示出内毒素和蛋白质独-特的结合位点。在理想的环境条件下由于配体对蛋白质的结合力弱蛋白质的回收率几乎接近100%。采用配体的内毒素去除法较少依赖溶液的pH值和离子力例如血清白蛋白溶液在中性条件下能不受蛋白质在此pH值时变为带负电荷的影响而仍有较好的纯化效果。


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