细菌内毒素定量光度测定法操作规程与有效性评估指南

一、概述

细菌内毒素检查法（定量检测）之光度测定法是一种利用光谱分析技术来测定样品中细菌内毒素含量的方法。此方法依赖于鲎试剂（一种从鲎的血液中提取的生物试剂，对细菌内毒素高度敏感）与内毒素反应产生的浊度变化，通过比色法量化内毒素水平。

二、标准曲线的制备

材料准备：用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个不同浓度的稀释液，稀释度不得大于10，浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。

试验设置：每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时设置2支阴性对照。

数据分析：当阴性对照在设定的时间内不发生反应时，对全部数据进行线性回归分析。标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，否则需重新试验。

三、光度测定法操作步骤

溶液准备：选择标准线中点或一个靠近中点的内毒素浓度，制备溶液A、B、C和D。

加样与保温：参照所用仪器和试剂的有关说明，确定供试品和鲎试剂的加样量、比例以及保温时间。每种溶液至少做2个平行管。

检测与计算：使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。通过溶液B和A的浓度差计算内毒素的回收率，确保其在50%-200%的范围内。

四、试验有效性判定

标准曲线可靠性：系列溶液C的结果需符合标准曲线的可靠性试验要求。

回收率：用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率应在50%-200%的范围内。

阴性对照：溶液D（阴性对照）在规定的反应时间内未检测出内毒素。

供试品判定：若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，则判供试品符合规定；若大于规定的内毒素限值，则判供试品不符合规定。

五、注意事项

严格遵守实验室操作规范，确保试验环境的洁净和稳定。

使用经细菌内毒素试验验证合格的无热原器具，以减少干扰和误差。

遵循所有关于内毒素旋涡震荡次数的建议，确保试验的准确性和可靠性。

定期对仪器进行维护和校准，以保证其性能的稳定和准确。

这种方法是药品、医疗器械及生物制品安全性评估中重要的一部分，确保产品无细菌内毒素污染，保障患者安全。