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免疫机制的多样性与TLR4在LPS识别中的关键作用

发布时间: 2024-07-01  点击次数: 86次

在哺乳动物体内发现至少存在10种TLRs分子,为何机体内存在多种TLRs?现已研究证实,这是由于宿主识别不同微生物的需要而形成的免疫机制,如在果蝇,Toll家族不同成员参与对不同病原菌的防御作用:Toll 主要介导抗真菌反应,18-Wheeler拮抗细菌感染。哺乳动物TLRs家族不同成员对微生物及其PAMPs的识别作用也存在相对的特异性。表7-3显示TLR家族成员不仅识别脂质和多糖(如LPS、肽聚糖),而且也与细菌或病毒DNA、RNA和蛋白质作用。



TLR4是研究最早、作用也最为明确的TLR分子。除细菌LPS外,近年来也发现了其他一些配体,如抗肿瘤药物泰素﹑热休克蛋白60(hsp60)等。识别的病原菌主要有革兰阴性菌、厌氧菌、致密螺旋体。有人认为,TLR4还能识别病毒融合蛋白(respiratory scyncytial virus,RSV),但该研究采用的动物是C57BL/10ScCr小鼠,这种小鼠体内同时缺失Tlr4和IL-12受体β2链基因。由于1L-12是天然免疫和适应性免疫拮抗病毒感染的关键细胞因子,以及C57BL/10ScCr小鼠对IL-12,无反应。因此,TLR4对RSV的识别作用尚待探讨。

TLR4虽能识别多种配体,但主要配体是细菌LPS,同CD14分子一样,作为一种重要的LPS兴奋性受体,在介导革兰阴性细菌及其LPS的宿主反应中发挥重要作用。研究结果显示,将TLR4基因转入不表达TLR4的细胞内,可使不具有LPS反应的细胞具有一定的LPS反应性。相反,将LPS反应细胞内的TLR4基因进行突变或缺失,细胞则出现LPS低反应性或耐受。抗TLR4抗体能抑制不同血清型肠道杆菌LPS刺激人THP-1细胞释放TNFα的作用,但对肽聚糖、热灭活金黄色葡萄球菌等无抑制作用。

此外,TLR4胞外区和胞内区的点突变也显示与人呼吸道LPS低反应性有一定的内在联系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外区缺陷人群中,骨髓干细胞移植后革兰阴性脓毒症的发生率为16.7%,而正常TLR4的受者中,其感染的发生率为6.6%,提示TLR4 胞外区的突变可增加内毒素血症的危险性。

然而,最能说明TLR4作为LPS重要受体的是近年来关于Lps基因的研究。1978年,James Watson首-次提出小鼠体内可能存在控制LPS反应的特定基因,取名为Lps,认为该基因可能有两个等位基因:即Lpsd(defective response>和Lpsn (normal response)。三种天然LPS低反应小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因为Lpsd,表现为对LPS刺激的耐受性。James Watson等通过基因作图将Lps基因座定位于小鼠4号染色体上。20世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展,先后有多个研究小组采用定位克隆策略,对Lps基因座重新进行精细作图,绘制出围绕Lps基因座染色体区的高分辨连锁图,最终将Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb长的片段内。

为了进一步明确Lps基因座内的候选基因及其编码蛋白,1998年Poltorak等对该重要区域进行高密度测序(近4万次),以及利用外显子捕获﹑选择性原位杂交和定位克隆等技术,在其区域内鉴别出多个基因,如TLR4基因、锌脂蛋白基因、Tera同构体基因、大部分Pappa基因序列(编码一种分泌型金属蛋白酶)、芳香乙酰胺脱乙酰基酶基因和astrotactin同构体基因,Tlr4是唯-一与LPS作用有关的基因,Tlr4全长基因都位于Lps基因座内。其他学者也获得同样结果。

进一步研究显示,C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位,即第3个外显子上出现一个碱基颠换:C→A。在LPS反应品系小鼠基因组DNA中未发现相应的碱基突变。此外,C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬细胞均能检测出Tlr4 mRNA,但不能检测出C57BL/10ScCr小鼠巨噬细胞的Tlr4 mRNA。上述结果说明,C3H/HeJ小鼠Tlr4为点突变,其突变并不影响Tlr4的转录,C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因则为完-全缺失,即为无效等位基因(null allele),有74723个核苷酸缺失,这包括了该基因的所有三个外显子,因而出现隐性突变。由于Tlr4位于Lps内,两种 LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均发生错义突变(missense mutation)或缺失,进一步证实Tlr4基因就是Lps的最佳候选基因。

进一步研究显示,T1r4基因的突变具有重要的功能意义。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3个外显子上的点突变虽不影响该基因的转录,但因其密码子的变化,使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸(proline)变为组胺酸(histidine)。该区域正为蛋白质的胞浆区,该胞浆区为进化中最保守的结构域,其结构域的完整性对于通过TLRs介导的LPS信号至关重要。这种氨基酸残基的替换改变了TLR4信号转导区域的拓扑结构,进而破坏了与下游分子蛋白一蛋白间的相互作用,从而表现出对LPS信号转导的共显性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完-全缺失,不能表达TLR4蛋白,因而出现对LPS反应的隐性消失(recessive abolition)。由此可见,C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突变表型分别与Tr4点突变或基因缺失非常吻合。

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