摘要
检测生物制药产品中可能存在的内毒素对患者安全至关重要。虽然内毒素分子本身是高度稳定的,但基质成分、储存温度和容器组成等各种因素都会影响其在制造收集并随后检测内毒素含量的样品时的稳定性。
位于马萨诸塞州安多弗的辉瑞制药公司开发了一个程序,用于创建内部天然内毒素(NOE)制剂,以评估内毒素在不同基质、温度和容器中的稳定性。使用NOE比使用市售的细菌内毒素工作标准品(CSE)更有优势,如增加实验室的灵活性和控制,辉瑞公司已使用内部天然内毒素(NOE)制剂来评估内毒素在不同基质和温度下的稳定性。
内毒素是一种脂多糖结构,位于革兰氏阴性细菌的细胞壁中。由于内毒素属于一类被称为热原的致热物质,因此可能含有内毒素的肠外用药产品会引起患者的热原反应。
FDA规定的内毒素限值为5EU/kg体重。超过此含量的内毒素限值可能会导致发烧、休克和死亡。出于安全性和合规性的考虑,在生物制造过程和产品中监测和控制内毒素含量至关重要。
鲎试剂(LAL)检测法通常用于检测生物制品中的内毒素含量。检测贯穿于整个纯化过程以及原料药和成品药生产过程的各个环节。有效的内毒素检测对于产品的安全性非常重要。因此,准确检测产品生产和释放过程中可能存在的任何内毒素至关重要。
尽管人们普遍认为内毒素分子本身具有高度稳定性,但各种基质、温度和/或储存容器都可能影响鲎试剂(LAL)检测法检测内毒素存在的能力。在马萨诸塞州安多弗的辉瑞专科护理中心启动了多项研究来探讨这些影响。 为了测量时间和/或温度对内毒素回收的影响,有必要在起始生物制药样品中加入内毒素。由于要对多种基质和温度进行评估,因此需要大量的内毒素才能完成这些研究。
细菌内毒素工作标准品(CSE)是一种商业上可用的内毒素类型。CSE用于为鲎试剂(LAL)检测法准备标准曲线和阳性产品对照(PPC)。CSE由获得许可的鲎试剂供应商从纯化的大肠杆菌菌株中制备,并在配方中含有填充剂。因此,CSE并不代表实际污染事件中可能存在的内毒素。此外,CSE通常不适用于高浓度的EU/mL配方。
自然产生的内毒素(NOE)由革兰氏阴性细菌产生,经过过滤但未经进一步处理,使其成为污染事件的代表性物质。此外,由于它可以培养到非常高的EU/mL浓度,因此适合用于加标研究。
对多种革兰氏阴性生物体进行筛选以产生NOE,以确定用于产生NOE制剂的潜在候选物。所有NOE溶液均通过在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上制备草坪培养物并在32°C下孵育24-48小时来制备。从培养皿中取出菌落,接种到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中,在32°C的振荡培养箱中培养过夜。将所得培养物离心,用0.45μm过滤器过滤,并使用动态显色法鲎试剂检测内毒素。表1-1列出了所评估的每种生物的EU/mL值。
先前在马萨诸塞州安多佛的辉瑞公司基地使用大肠杆菌和粘质沙雷氏菌制剂进行的NOE加标研究非常有用,因为它们产生了高浓度的EU/mL储备溶液,并且在很长一段时间内保持稳定。产生高浓度内毒素的生物体特别适用于加标研究,因为这些制剂可以灵活地测试低和高的加标浓度。
由于这些制剂产生的内毒素浓度远远高于常规使用时的水平,因此每次使用前都必须确认实验室制备的NOE储存液的浓度,以便制备准确的加标溶液。
在产品生产和发布过程中对LAL检测进行常规使用验证时,会将CSE形式的内毒素作为PPC添加到已稀释的样品中,以评估基质抑制/增强作用。验证活动重点关注干扰因素测试,通过确定PPC加标回收率(即,加标到PPC中的内毒素的回收率必须达到 50-200%)来评估样品基质是否会干扰内毒素检测。当加标回收率在可接受的PPC加标回收范围内,并且与USP第<85>章中设定的参数一致时,选择样品稀释。
LAL验证研究的设计通常会考虑到样品基质的影响,即样品稀释到一定程度后,检测中不再出现干扰,这是由稀释样品中PPC加标回收率决定的。在这种情况下,PPC中的内毒素只有在稀释后才会与样品发生作用,而不是在开始时。
为了确定样品基质对内毒素的影响,在进行常规LAL检测之前,内毒素必须与未稀释的样品基质相互作用。
使用NOE最初加标未稀释的样品更能代表污染事件,因为这种污染的来源很可能是细菌来源,而不是来自加工后的内毒素来源(如CSE)。
PPC加标和NOE加标的作用之间的主要区别在于,PPC加标提供有关样品基质是否干扰检测本身的检测措施的信息,而NOE加标提供有关样品基质与内毒素直接相互作用的信息。图1说明了使用动力学LAL检测法进行常规检测和NOE加标研究之间的区别。
在许多情况下,LAL样品运到检测实验室后,要放置一段时间才能开始检测。应进行研究,以评估该保持时间对特定样品类型内毒素回收的影响。NOE对于这些研究非常有用,因为实验室可以很容易地制备和储存高浓度的EU/mL储存液,从而可以相对简单地制备出各种内毒素浓度的加标样品。
在进行LAL检测之前,通过在未稀释的样品中添加NOE来进行保持时间研究。立即对加标样品进行分析以确定起始浓度,并在设定的时间点储存和分析等分试样。通过在未稀释的样品中加入NOE,可以在初始时间点以及样品的储存时间和温度下确定产品和基质对可能存在的任何内毒素的影响。在这些研究中使用动力学LAL测定法,因为结果是定量的,可以确定每个时间点的内毒素量。
表1-2显示了在2-8°C温度下将两种不同的缓冲液保持3周时,使用掺入NOE的两种缓冲液进行保持时间研究的结果,表1-3显示了在-80°C温度下,将两种缓冲液保持3个月时,使用掺入相同两种缓冲液进行保持时间研究的结果。这些结果表明,无论在何种温度下,内毒素都可以从缓冲基质中回收。
保持时间研究的一个重要考虑因素是确认最初加入的内毒素量。当NOE加入后直接测定起始时间点时,必须考虑样品基质是否对内毒素回收率有直接影响。为了证明没有样品基质干扰,在无热原水(LRW) 中进行了相同的加标。表1-4说明了此无热原水加标确认的使用情况。本研究使用了三种不同的NOE加标水平,由目标NOE加标量表示。测试样品和无热原水栏下的实际回收量在LAL测定可变范围内,且表明不存在样品基质的干扰。
以下研究(表1-5)清楚地说明了在无热原水中对起始时间点进行加标确认的重要性。将NOE加标到测试样品中并立即进行测定以确定起始NOE浓度。NOE以三种不同的浓度加标,由目标NOE加标表示。在所有三种加标水平的稀释度测试中,内毒素回收率均低于检测限值。然而,由于没有进行无热原水确认,因此很难确定是否存在稀释或测定误差,或实际的基质或产品干扰。
这项研究以两种不同的加标水平重复进行,无热原水确认样品与测试样品同时进行(表1-6)。添加无热原水确认样品清楚地表明,样品基质存在干扰,导致检测样品中无法检测到内毒素。
在这种情况下,需要进行多项研究来确定样品基质干扰的原因。 使用实验室制备的NOE储存液提高了实验室在短时间内进行多项研究的效率,并允许使用从5EU/mL到3500 EU/mL的加标浓度。表1-7显示了一项使用不同测试样本的研究数据,该样本的 NOE加标非常低(5-40 EU/mL)。在这种情况下,测试样本和无热原水确认样本的内毒素回收率是一致的,表明没有基质干扰。
研究人员还使用了来自几种不同生物的制备物,为收集到的数据增加了稳定性和可变性。这突出了使用内部NOE制备物的额外好处,因为来自多种生物的制剂可以在需要时快速制备和使用。
表1-8显示了使用表1-5和表1-6中的相同测试样本生成的部分数据,其中有来自高浓度EU/mL NOE生成物(粘质链霉菌)和低浓度EU/mL NOE生成物(A. 基因组)的加标。 两者的目标浓度均为200 EU/mL,并显示出相似的回收率,进一步表明测试样品干扰了内毒素的回收,而不是任何检测错误或特定内毒素来源的问题。
本报告中提供的数据用于说明测试各种基质、温度和储存时间对在测试前将在实验室中放置一段时间的样品的内毒素回收的干扰的重要性。了解内毒素和样品基质在起始时间点的相互作用尤为重要,因为此时可能存在的任何基质抑制都会被识别。在执行此测试或对在NOE被掺入测试样品基质时表现出抑制的基质进行故障排除时,使用实验室制备的NOE原液大大增加了可用的测试选项的灵活性、效率和范围。当在起始时间点遇到基质抑制时,需要开发替代测试方法,在这种情况下NOE也非常有用,因为确认内毒素是否成功回收对于任何替代方法的实施都至关重要。