不同内毒素破坏方法的比较研究

一、介绍

干热法是制药行业公-认的去热原方法。本文介绍了一系列研究，以确定除干热法外，是否还能用其他方法成功去除热原。去热原是指去除或灭活热原。在实践中，通过证明去热原工艺能够将细菌内毒素降低到可接受的水平来对其进行鉴定。与灭菌一样，去热原是一个绝对的术语，由于测试不敏感，只能在理论上进行证明[1]。

玻璃器皿的去热原在肠胃外药物的生产中非常重要，因为残留的热原最终可能被注射到患者体内，导致不良反应。在实验室中，用于细菌内毒素检测的玻璃器皿必须进行去热原处理，以最-大-程-度地减少检测污染；采样容器也必须不含热原，以避免样品污染和检测到假阳性结果[2]。对注射用药物生产中使用的玻璃器皿构成风险的主要热原物质是内毒素。内毒素是革兰氏阴性菌外壁中含有的天然热稳定脂多糖[3]。它在细菌细胞死亡、裂解、生长和增殖过程中释放到环境中 [4, 5]。由于其普遍性和效力，内毒素被认为是最重要的热原[6]。

与药物相关的内毒素的一个问题是它们具有热稳定性，使其能够抵抗大多数传统的灭菌过程，因此需要对活细胞和内毒素进行单独的测试。。制药工艺和设备面临内毒素的风险。因此，去热原是在药品制备过程中保持无菌保证的重要因素。有几种不同的方法来实现去热原（包括超滤、离子交换色谱和使用酸碱水解）。可以说，最常见的去热原设备是那些使用干热操作的设备（例如使用单向热空气的去热原通道，用于准备初级包装物品（产品小瓶）以进行无菌灌装[7]。

监管机构对去热原的要求各不相同。欧洲药典规定用于热原测试的玻璃在 250°C 下干热 30 分钟，或在 200°C 下干热 60 分钟以进行去热原，但对于用于注射用的玻璃器皿的去热原没有书面要求 [8]。用于鲎试剂测试的玻璃器皿必须进行去热原处理，使其水平低于测试的灵敏度。USP<1211>和 FDA 指南不包含温度规范，但要求内毒素从至少 1000个内毒素单位（EU）的起始浓度减少3对数（log），以进行去热原[9]。

就去热原反应而言，干热灭活时，内毒素遵循线性对数减少曲线，直至减少至3对数。这种破坏持续发生但不一定遵循线性回归后，而是“双相"减少[10]。

内毒素指示剂

使用内毒素指示剂评估内毒素的减少情况，所述内毒素指示剂使用源自大肠杆菌o113:H10的对照标准内毒素（CSE）制剂制备的。使用的CSE应类似于使用鲎试剂（LAL）方法进行常规细菌内毒素试验（BET）所用的内毒素，并可追溯到参考标准。

细菌内毒素工作标准品(CSE)

行业内对如何制备内毒素指示剂存在一些争议；制备内毒素指示剂的方法有两种，一种是将内毒素添加到要去热原的物品表面并将其烘干，另一种是使用预先制备好的内毒素指示剂来实现的。 在这两种方法中，笔者更倾向于第一种方法。因为内毒素直接用于去热原的设备表面[11]，这种方法被认为更具挑战性。

二、研究设计

这项研究的目的是确定除干热法外，是否还能用其他方法成功去除热原。研究了两种替代方法：湿热（高压灭菌）和苛性碱冲洗，并将结果与干热去热原进行了比较。[12]

三、验收标准

目前还没有针对玻璃最终产品容器的药典内毒素耐受限值 (K)，因此本研究采用了医疗器械的限值，即0.5EU/ml。

四、方法学

本研究选择的方法为动态浊度法LAL（鲎试剂）试验（根据《欧洲药典》<2.6.14>中的细菌内毒素试验）。LAL试验基于从鲎中分离出来的裂解酶，这种酶在内毒素存在的情况下会凝结成块[3]。在实践中，对于动态浊度法试验，LAL反应速率是用达到预定的“阈值"光密度所需的时间来表示的，称为起始时间[13]。内毒素浓度越高，起始时间越短。内毒素浓度是根据标准曲线（大肠杆菌内毒素标准）计算得出的，该曲线是通过对数起始时间与对数内毒素浓度的线性回归计算得出的[14]。样品、标准品和对照品至少进行一式两份的测试。阳性产品对照回收率应在50-200%的范围内。

这项研究使用了用注射用水冲洗过的玻璃瓶，制备了50000 EU/ml的内毒素溶液。用0.1ml溶液接种到小瓶中，得到理论上5000EU的加标值，并在单向气流柜中风干过夜。之所以选择0.1 ml的接种量，是因为有文献报道，较小的接种量可减少吸附，从而使小瓶中的内毒素回收率更高且更稳定。制备完成后，将内毒素指示剂与两个阳性对照一起放置在去热原装置中的指-定位置（10 个内毒素指示剂被认为足以评估去热原能力）。

五、处理和测试

共进行了三种处理：

1、干热：将小瓶在250°C的Carbolite烘箱中处理30分钟。《美国药典》热原测试章节<151>中规定，在250°C下加热不少于30分钟以去除玻璃器皿和器具的热原。

2、湿热：将小瓶在121°C下高压灭菌30分钟；该高压灭菌周期是用于对设备进行消毒的标准循环。

3、苛性碱：每个小瓶用10ml的0.1 mol/L氢氧化钠冲洗1分钟。据文献报道，这种浓度的苛性碱能够去热原[17]。进行 1 分钟的清洗是因为它是可行的，并且如果显示成功的话可以很容易地实施和进行。

除干热外，每种处理均进行三次运行，因为结果表明，前两次运行后去热原 100% 成功（正如已建立的成熟技术所预期的那样）。

处理后，每个小瓶加入5ml缓冲液，并在超声波浴中超声处理15分钟，然后放置在轨道振荡器上直至测试。在测试之前，将所有瓶子涡旋混合一分钟。文献中建议将超声波处理和涡流相结合，以实现最佳的内毒素回收率。

所有样品均根据 5.0 EU/ml 至 0.005 EU/ml 范围内的标准曲线进行重复检测。阳性对照、湿热处理后样品和苛性碱处理后样品需要稀释，以使可检测的内毒素处于标准曲线的范围内。每次检测至少有一个处理过的样品和所有对照组都加了 0.5 EU/ml 的内毒素。检测样品时，在裂解反应管中用 LAL 试剂水进行 1:2 稀释（对于需要稀释到标准曲线范围内的样品和对照组，在检测过程中还需进行 1:2 的稀释）。对于阳性产品对照，用1.0 EU/ml内毒素标准溶液进行1:2稀释，得到与测试样品相同的稀释度，但内毒素加标量为0.5 EU/ml。阳性产品对照加标回收率在50-200%之间表明没有干扰，稀释液适合测试。

六、结果

（一）数据分析

使用Microsoft Excel™和Systat 11™进行数据分析。采用双向方差分析来检验三种处理之间是否存在显著差异。使用学生t检验证实了差异。由于所测得的处理后内毒素浓度取决于每次运行的初始峰值，因此统计分析是根据内毒素减少对数而不是所测得的实际内毒素进行的。这种方法降低了检测到虚假意义的风险，并且不假设数据来自同一人群。

统计分析表明，干热是去热原最-有-效的处理方法，比湿热和碱处理更能显著降低内毒素。虽然干热处理是最-有-效的方法，但湿热处理和苛性碱处理后内毒素的平均对数下降值都是1.7，因此这两种去热原方法之间没有显著差异。

（二）讨论

这项研究检验了三种不同处理方法对玻璃器皿的去热原效果。结果表明，干热处理能稳定地去除所有加标瓶中的热原，使内毒素减少 3 个以上的对数下降值。这是意料之中的，因为干热是一种普遍接受的去热原方法。

尽管对干热破坏内毒素的机制尚未得到明确研究，但这可能是由于高温导致分子不加选择地焚烧造成的。 Ludwig和Avis [15] 认为这是一种以自由基为介质的氧化反应，由生产过程中产生的痕量金属催化。这项研究表明，采用湿热法，传统的高压灭菌循环在降低内毒素浓度方面的效果远不如干热法。所有经过湿热处理的瓶子都没有达到 3-log的去热原目标，而且所有测试瓶子的处理后内毒素含量都超过了4 EU/ml。内毒素的热稳定性是众-所-周-知的，传统的高压灭菌湿热处理无法有效去除热原。有报道称，在过氧化氢存在的情况下，通过高压灭菌可成功去除热原，这种情况下的破坏被认为是由于脂多糖脂质A部分的脂肪酸被氧化所致[16]。 此外，长时间的高压灭菌也被证明可以成功地去除热原。这些都是未来研究中可以探索的途径，但这两种方法对于一般实验室来说都不可行。

用氢氧化钠处理加标瓶对内毒素有负面影响，然而，3-log去热原目标无法始终如一地实现。虽然许多瓶子中的内毒素降至低于可接受限值的水平，但这种情况并不一致。应当注意，苛性碱的清洗是手工进行的；因此，去热原过程中的不一致性可能与可能与混合过程的变化有关。

苛性碱处理过程中的破坏机制是由于内毒素脂质A部分中发现的酯和酰胺键的水解。酯键的碱性水解产生醇和酸式盐称为皂化，加热可增强皂化效果[17]。因此，通过在苛性碱处理中加入加热阶段，可能会更有效地减少内毒素。

七、结论

干热被认为是-最有-效的去热原方法，其效果明显优于湿热和苛性碱处理法。因此，这项研究支持大多数文献中的普遍结论。

干热持续实现内毒素减少超过 3个对数级。本研究中的湿热和碱处理方案不能一致地去热原。与干热相比，这两种替代方法都没有达到相同的可量化的内毒素破坏水平。

本研究中使用的玻璃瓶在处理前已用注射用水冲洗过。购买的玻璃瓶通常含有杂质，需要冲洗。回收的玻璃器皿可能有化学和生物沉淀物，可能会扭曲或掩盖残留的内毒素。

这些杂质和残留物可能会影响玻璃的去热原处理，应在处理前将其去除；因此，有必要制定玻璃器皿去热原处理的准备程序。采取措施减少内毒素是微生物控制的一个重要部分，这涉及到药品加工以及需要制备材料或测试成分的实验室。这与内毒素的风险有关。内毒素注射后的病理效应是核心体温迅速升高，随后出现极快和严重的休克，往往在诊断出病因之前就已经死亡[18]。

参考文献

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3.Williams, K.L. (2001). Endotoxins: Pyrogens, LAL testing and Depyrogenation 2nd Edition. Drugs and the Pharmaceutical Sciences Volume 111. Marcel Dekker Inc., New York, USA. Chapters 1, 2, 7 & 8.

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13.Cooper, M.S. (1996). Bacterial Endotoxins. The Microbiological Update 14 (1): 1-4

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18.Tours, N. and Sandle, T. Comparison of dry-heat depyrogenation using three different types of Gram-negative bacterial endotoxin, European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, Volume 13, No-1, 2008, pp17-20+