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特异鲎试剂制备的方法

发布时间: 2022-09-27  点击次数: 192次

自从1981年日本学者Kakinuma A 等报道“一种抗癌物质( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使试剂凝聚"以来,由于其涉及细菌内毒素检查的特异性,引起各国学者的注意。

 

 

一、(1-3-β-D-葡聚糖的本质与来源

 

Kakinuma A等在作抗癌物质葡聚糖热原试验时,不含发热物质的葡聚糖能引起试验呈阳性反应Loretta APearsen FC也报道血液透析器上存在试验反应物质LAL-Reactive Materia lLAL-RM,以后有报道凡经过铜铵人造丝透析膜的制品均存在使试验阳性但不是内毒素的物质。1983年日本学者中村隆范报道了这一物质具有如下结构:

 

1-3-β-葡聚糖外,1-41-6-β-葡聚糖同样使试验产生阳性结果这些物质的总称为真菌多糖Fungal polysaccharide,普遍存在于真菌细胞壁。如果这类物质具有像内毒素一样的致热活性细菌内毒素检查和热原检查结果的符合率会接近一致。但是恰恰相反,真菌多糖似乎不是一种致热物质,文献报道1.00.010. 0001mg/mL的真菌多糖溶液剂量按10mL/kg,进行热原试验的结果3h3只家兔最高升温的均值分别为0.23±0.030.13±0. 090.20±0.10。这将导致在使用普通试剂检测某些样品时出现细菌内毒素检查不合格,热原检查合格的现象。造成对这些物质热原检查的错判。1990Ikemura K等将试验反应机理和各种干扰内毒素检查物质及干扰部位归纳如下:

 

 

由此可知,鲎试剂检测内毒素出现非特异性结果是不奇怪的。为了使细菌内毒素检查与热原检查的结果趋向一致,使用特异试剂是*必要的。

 

二、特异试剂制备

 

1968Levin JBang F B创建试剂以来,使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法,已被举世*并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载,但是由于上述非特异性的存在,使这一试验的实际应用受到一定限制。为了克服这一弊端各国学者进行了深入研究。由于上述试验反应机理已被阐明,设法阻止右侧旁路反应,便能使试剂对内毒素的检测达到特异性的目的。

 

日本最先推出的特异试剂其商品名为En-dospecy其生产工艺的特点是将普通试剂中存在的G因子,以亲和层析方法分离去除。国内有人称无G因子试剂。显然,试剂中没有G因子,即使被测样品中存在真菌多糖非内毒素,也不能产生活化的G因子在反应旁路系统中就不能激活凝固酶原旁路反应被阻断,使成为对内毒素具有特异性。

 

国内吴伟洪等报道以同样方法制备了仅含CB因子的试剂。但是以这种工艺制备的特异试剂由于在分离G因子的过程中,必需防止带入微量内毒素,即所用分离试剂、柱床、器皿及操作过程,严防内毒素污染,不仅增加了制备工艺的难度,也必然增加试剂的成本,因此很难推广应用。

 

1989Berzofsty R N报道在制备普通试剂时,为了提高检测内毒素的灵敏度,均采用氯仿提取存在于试剂粗制品中的抗LPS脂多糖因子。氯仿提取的结果确实增加了试剂的灵敏度,但同时将存在于试剂粗制品中的抗G因子一同除去,这就使普通试剂易被真菌多糖激活增加了普通试剂的非特异性。因此提出不用氯仿提取改用一种特殊试剂,只除去抗LPS因子,而保留抗G因子,以达到即增加了对内毒素的敏感性,又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。这是从试剂的生产工艺上进行改革,实现提供商品特异试剂的一种方法。

 

1990Tsuchiya M报道,由于真菌多糖与普通试剂反应形成凝胶有一个特定浓度范围10 -3~10-6mg/mL,大于或小于这个浓度都不能成胶故在制备普通试剂的基础上,加入过量的真菌多糖( 1mg/mL),可阻止G因子的活化“封闭"了旁路达到制备特异试剂的目的。显然采用这一措施制备特异试剂较以上两种方法既简便又经济,可使特试剂商品化。

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