特异鲎试剂制备的方法

自从1981年日本学者Kakinuma A 等报道“一种抗癌物质( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使鲎试剂凝聚"以来，由于其涉及细菌内毒素检查的特异性，引起各国学者的注意。

一、（1-3）-β-D-葡聚糖的本质与来源

Kakinuma A等在作抗癌物质葡聚糖热原试验时，不含发热物质的葡聚糖能引起鲎试验呈阳性反应。Loretta A和Pearsen FC也报道，血液透析器上存在鲎试验反应物质（LAL-Reactive Materia l，LAL-RM），以后有报道凡经过铜铵人造丝透析膜的制品，均存在使鲎试验阳性，但不是内毒素的物质。1983年日本学者中村隆范报道了这一物质具有如下结构:

除（1-3）-β-葡聚糖外，（1-4）、（1-6）-β-葡聚糖同样使鲎试验产生阳性结果，这些物质的总称为真菌多糖（Fungal polysaccharide），普遍存在于真菌细胞壁。如果这类物质具有像内毒素一样的致热活性，细菌内毒素检查和热原检查结果的符合率会接近一致。但是恰恰相反，真菌多糖似乎不是一种致热物质，文献报道1.0、0.01、0. 0001mg/mL的真菌多糖溶液，剂量按10mL/kg，进行热原试验的结果，3h内3只家兔最高升温的均值分别为0.23±0.03，0.13±0. 09，0.20±0.10。这将导致在使用普通鲎试剂检测某些样品时，出现细菌内毒素检查不合格，热原检查合格的现象。造成对这些物质热原检查的错判。1990年Ikemura K等将鲎试验反应机理和各种干扰内毒素检查物质及干扰部位归纳如下:

由此可知，鲎试剂检测内毒素出现非特异性结果是不奇怪的。为了使细菌内毒素检查与热原检查的结果趋向一致，使用特异鲎试剂是*必要的。

二、特异鲎试剂制备

1968年Levin J和Bang F B创建鲎试剂以来，使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法，已被举世*，并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载，但是由于上述非特异性的存在，使这一试验的实际应用受到一定限制。为了克服这一弊端，各国学者进行了深入研究。由于上述鲎试验反应机理已被阐明，设法阻止右侧旁路反应，便能使鲎试剂对内毒素的检测达到特异性的目的。

日本最先推出的特异鲎试剂其商品名为En-dospecy其生产工艺的特点是将普通鲎试剂中存在的G因子，以亲和层析方法分离去除。国内有人称无（弃；去）G因子鲎试剂。显然，鲎试剂中没有G因子，即使被测样品中存在真菌多糖（非内毒素），也不能产生活化的G因子，在反应旁路系统中就不能激活凝固酶原，旁路反应被阻断，使成为对内毒素具有特异性。

国内吴伟洪等报道，以同样方法制备了仅含C、B因子的鲎试剂。但是以这种工艺制备的特异鲎试剂，由于在分离G因子的过程中，必需防止带入微量内毒素，即所用分离试剂、柱床、器皿及操作过程，严防内毒素污染，不仅增加了制备工艺的难度，也必然增加鲎试剂的成本，因此很难推广应用。

1989年Berzofsty R N报道，在制备普通鲎试剂时，为了提高检测内毒素的灵敏度，均采用氯仿提取存在于鲎试剂粗制品中的抗LPS（脂多糖）因子。氯仿提取的结果确实增加了鲎试剂的灵敏度，但同时将存在于鲎试剂粗制品中的抗G因子一同除去，这就使普通鲎试剂易被真菌多糖激活，增加了普通鲎试剂的非特异性。因此提出不用氯仿提取，改用一种特殊试剂，只除去抗LPS因子，而保留抗G因子，以达到即增加了对内毒素的敏感性，又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。这是从鲎试剂的生产工艺上进行改革，实现提供商品特异鲎试剂的一种方法。

1990年 Tsuchiya M报道，由于真菌多糖与普通鲎试剂反应形成凝胶，有一个特定浓度范围（10 ^-3~10^-6mg/mL），大于或小于这个浓度都不能成胶，故在制备普通鲎试剂的基础上，加入过量的真菌多糖( 1mg/mL)，可阻止G因子的活化，即“封闭"了旁路，达到制备特异鲎试剂的目的。显然采用这一措施制备特异鲎试剂，较以上两种方法既简便又经济，可使特异鲎试剂商品化。